活化元件基因对Pseudomonas putida 5B腈水合酶生物合成的调控机制研究

Nitrile hydratases (NHases) have considerable practical importance as biocatalysts for industrial production of acrylamide. However, attempts to heterogeneous expression by cloning the structural gene of NHases in E. coli were disappointing due to formation of inactive and insoluble forms. Recent studies found that the NHase gene always exists as a complex cluster, and some elements in the gene cluster were potentially essential for the active expression of NHase. In this project, the biosynthesis of NHase from Pseudomonas putida 5B will be studied. The order of structural gene is αβ, which is different to reported Co-type NHase from Rhodococcus rhodochrous J1. By gene recombination technology and renaturation in vitro, the biosynthesis process will be restructured in E. coli. Furthermore, the function and mechanism of activator gene in NHase gene cluster. The research may be helpful to design efficient expression system and directed evolution of the NHase.

腈水合酶是一类重要酶制剂，在催化合成丙烯酰胺等化学品中体现出无可替代的应用优势。然而当单独克隆腈水合酶的结构基因在E. coli细胞中异源表达时，重组蛋白没有表现出任何相应的水合活力。通过研究发现，腈水合酶基因在细菌基因组中通常以复杂的基因簇形式存在，而且某些基因区域对其异源功能表达至关重要，其中活化元件基因的影响较为明显，但是其调控功能和机制并不清楚。本项目将针对P. putida 5B腈水合酶的胞内生物合成过程进行研究，试图阐明基因簇中活化元件基因的调控机制。该酶代表另一类Co型腈水合酶，其结构基因的序列为αβ。我们将采用基因重组和体外再生策略，在E. coli细胞中重新构建该腈水合酶的生物合成过程，重点阐述活化元件基因的调控功能和机制。通过本项目的研究，期望为腈水合酶的胞内合成机理研究提供可参考价值，并为构建高效的异源表达系统和蛋白质定向进化奠定工作基础。

腈水合酶是一类多亚基金属酶，催化腈生成相应的酰胺，在酰胺类化学品制造中显示出无可替代的应用优势。腈水合酶基因总是以复杂的基因簇形式存在，其中某些元件基因对其生物合成至关重要，尤其是活化元件基因。本项目主要针对一类钴型腈水合酶活化元件在其生物合成过程中的调节功能进行研究，其基因簇中腈水合酶基因顺序为-α-β-。本项目通过基因探矿策略发现一种来源于Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1的腈水合酶，其基因顺序为-α-β-，并在E. coli BL21(DE3)细胞中实现了功能表达。该重组腈水合酶表现出良好的热稳定性，以及针对芳香族腈的高效催化活力。我们进一步确定了该钴型腈水合酶基因簇中α亚基、β亚基和活化元件的基因序列，证明活化元件基因对其重组功能表达至关重要。基于腈水合酶基因簇结构构建了不同的重组质粒，以及腈水合酶的体外活力恢复策略，证明了活化元件参与了腈水合酶的生物合成，该调控机制被称为亚基自交换。活化元件与α亚基形成复合体，在α亚基中含有Co离子，而且相应的Cys残基也被氧化修饰，其与apo-α2β2脱辅基蛋白的α亚基进行交换，进而合成具有水合活力的腈水合酶。本项目同时考察了来源于E. coli的分子伴侣GroEL/ES或DnaK/J-GrpE（质粒pGro7和pKJE7）对钴型腈水合酶表达的调节作用，实验结果证明出分子伴侣和活化元件的功能类似，促进钴离子转移到腈水合酶内部，以及后续的蛋白质结构改变，促使腈水合酶催化活力的生成。本项目的研究工作为腈水合酶的胞内合成机理研究提供了可参考价值，并为后续的蛋白质定向进化研究奠定工作基础。