Pseudomonas putida中激酶蛋白StyS磷酸信号传导作用对靛蓝色素生物合成的调节效应及其机制研究

Indigo is an important category of food pigment, therefore the natural indigo biosynthesis has a significant research value and application prospect. Our previous results showed that there was a two-component regulating system StyS-StyR upstream the key enzyme gene styAB of indigo biosynthesis in Pseudomonas putida B3. The StyS belongs to the kinase family as an important media in phosphorylation signal transduction. However, the trans-autophosphorylation mechanism of StyS and the regulatory effect of phosphorylation signal transduction on indigo synthesis pathway have not been studied clearly. In this study, the gene expression regulating mechanism of phosphorylation signal transduction controlled by kinase will be proved, and the molecular mechanism of substrate inducing expression will also be confirmed, through analyzing the phosphorylation signaling pathway and its regulatory effect of StyS. The research results will provide the theoretical basis and research foundation for the construction and commercial application of high yield bio-indigo fermentation system in future.

靛蓝色素是一种重要的蓝色系食用色素，生物合成天然靛蓝色素具有重要研究价值和应用前景。前期研究发现，Pseudomonas putida B3中靛蓝色素合成关键酶基因苯乙烯单加氧酶基因styAB上游存在二元调控因子StyS-StyR。该二元系统中StyS属激酶蛋白，是磷酸化信号传导的重要媒介。但是，激酶蛋白StyS的自磷酸化及转磷酸化的传导机制尚未探明，此磷酸信号传导过程对靛蓝色素生物代谢途径的调节效应及其作用机理尙不明确。本项目拟通过分析靛蓝色素合成关键酶基因的表达调控因子StyS的磷酸化传导过程及调节效应，明确激酶蛋白控制的磷酸信号传导作用调节基因表达的调控机理，探明底物诱导表达的分子调节机制，为靛蓝色素高效发酵体系的构建和工业化推广奠定了理论依据和研究基础。

在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida B3中，靛蓝生物合成关键酶基因styAB上游存在一个二元调控系统styS-styR。StyS蛋白属于激酶家族，是磷酸化信号转导的重要媒介。项目通过质谱检测结果发现了两个磷酸化结合位点，并利用分子学手段构建了磷酸化位点突变株。分析野生菌株B3、styS基因缺失菌株B3-ΔstyS、styS基因回补菌株B3-ΔstyS-8和磷酸化位点突变株B3-ΔstyS-1之间的靛蓝产量及酶活发现，菌株B3产量为10.14mg/L，B3-ΔstyS-8产量为3.63mg/L，磷酸化位点突变菌株无激酶活性且失去了产生靛蓝的能力。结果表明，该菌株的磷酸化位点在靛蓝发酵体系中起重要作用。构建得到激酶蛋白StyS和调节蛋白StyR异源表达菌株，并通过添加分子伴侣以及对IPTG诱导条件的优化，提高了激酶蛋白StyS可溶性蛋白的表达量，研究结果表明，经镍柱纯化后激酶蛋白StyS浓度为0.23mg/mL，调节蛋白StyR浓度为0.5mg/mL。分子相互作用仪研究结果表明激酶蛋白StyS与调节蛋白StyR之间无相互作用，通过StyS蛋白与StyR蛋白的体外孵育实验以及EMSA方法，明确了StyS蛋白具有促使StyR蛋白磷酸化的作用，StyR蛋白与styAB启动子存在交互作用，且蛋白与DNA的结合位点为styAB启动子内部的回文结构。对苯乙烯不同诱导条件进行探索时发现，当发酵液中苯乙烯浓度为20%时靛蓝产量最高，且最适温度为30℃，发酵时间36h后靛蓝产量趋于稳定。结果表明添加苯乙烯后能够促进激酶蛋白StyS的激酶活性，使其自磷酸程度增强，从而靛蓝生物合成水平提高。本课题的完成，将对靛蓝色素生物合成高效细胞工厂的定向构建和天然色素绿色生产技术的开发提供理论基础和技术指导。. 项目资助发表科研论文2篇，待发表论文1篇。项目资助经费24万元，支出23.55万元，各项经费支出与预算相符。结余经费0.45万元，用于本项目后续研究支出。