Pseudomonas putida ND6中冗余降解基因（簇）的调控机制及分子生态学意义

The redundancy degradation genes and clusters exists widely in polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degradation strains and plays an important role. Microbial communities possess these redundancy genes and clusters as evolutionary advantages which could enhance their resistivity and stabilization in PAHs disturbance. The study on cooperation mechanisms and molecular ecological significances of redundancy degradation genes and clusters is helpful to bioremediation. Pseudomonas putida ND6 is a good model to study the cooperation mechanisms and molecular ecological significances of redundancy degradation genes and clusters. The reason is as follow. There is more than one kind of degradation genes and clusters in ND6 strain and we have studied on them for almost ten years. The physical roles of them had been demonstrated. Moreover, the genome and plasmids of ND6 strain had been previously sequenced and annotated. Two parts of work will be carried out in this study. One is demonstrating the regulation mechanisms of redundancy degradation genes and clusters in ND6 strain. Another is making an "overall view" insight on the types, distribution patterns and responses to the environmental disturbances, in order to understand the molecular ecological significance of redundancy degradation genes and clusters deeply.

很多芳香烃降解菌中存在冗余降解基因（簇）并发挥着重要作用。冗余降解基因（簇）作为一种进化优势，在环境受到扰动时能够增强微生物群落的抵抗力和恢复力。对其协同作用方式和分子生态意义的研究有助于生物修复工作的开展。Pseudomonas putida ND6具有多个冗余降解基因簇，对其生物学功能的研究已有一定的基础，而且ND6菌株完成了全序列测定，环境安全性好，是很好的研究模型。本研究计划开展两部分工作。第一，以ND6菌株为材料，继续加深对冗余降解基因（簇）调控机制的研究。第二，采集芳香烃污染程度不同的土壤样本，"全景式"观察环境中冗余降解基因（簇）的类型，分布规律，对环境胁迫的响应机制并争取发现新的冗余降解基因（簇）。通过这些工作加深对冗余降解基因（簇）存在的分子生态学意义的理解。

Pseudomonas putida ND6是一株高效萘降解菌株。前期研究表明，冗余降解基因（簇）的存在可能是ND6菌株高效降解萘的分子基础。本研究进一步阐明了冗余降解基因（簇）的调控机制及其分子生态学意义。.主要成果如下。.成果一：证实了ND6菌株染色体上冗余的儿茶酚邻位开环途径确实进行交互调控的科学假设。发现其可能为诱导型负调控模式，这一种调控模式还未见在萘降解菌株中报道，而且基因簇中的每个功能基因除了能够随基因簇共转录外，也能够自我单独转录，这种复杂和特殊的表达调控模式的产生很可能是对ND6菌株中多条降解途径共存的一种适应。.成果二：证实了pND6-1质粒上的萘降解上游操纵子和冗余的降解途径均受到NahR蛋白正调控，水杨酸为诱导物，而下游操纵子则受到NahR蛋白负调控的科学假设。发现敲除调控蛋白NahR后，经过20小时延滞期后，原本丧失了在萘降解培养基里生长能力的ND6菌株突然恢复了萘降解能力，这提示我们可能有另外的萘开环酶系存在，但为何需要经过20个小时才能表达，需要进一步研究。.成果三：初步认识了一些芳烃冗余降解基因分布规律：①负责儿茶酚开环的基因冗余度最高，其中以编码C23O的基因为主，而编码C12O基因冗余度稍低；②负责萘开环的酶系并不保守，联苯降解酶系也能完成萘的降解，因此，结构相似芳烃的降解酶系共存也可以看做一种广义上的冗余；③活性污泥中负责芳烃降解的菌目与土壤和环境水样中筛选得到的芳烃降解菌目差异较大。.成果四：比较了ND6菌株中冗余度最高的萘降解酶C12O和4个C23O之间的酶学性质差异。对酶学常数的比较研究表明，4个C12O与底物的亲合能力均较高，在较低的底物浓度时就能达到最大反应速率，但其最大酶活力则比C23O小。通过对最适pH、最适温度、pH适应性、温度适应性、金属离子对酶活性的影响等酶学性质的比较研究，我们发现ND6菌株中4个C12O的酶学性质大体相近而又存在差异，这种差异性能够帮助菌株提高对环境的适应能力，是微生物应对不利变异的保险策略。.