利用斑马鱼模型研究心脏特异表达基因Pygo1基因在左右不对称发育中的作用

申请人前期研究工作基础表明，斑马鱼Pygo1基因在胚胎早期发育阶段不对称表达，在结节和左侧侧板中胚层区域强烈表达， Pygo1-MO敲低 Pygo1表达的初步研究结果显示其心脏左右不对称发育信号紊乱，提示该基因可能与斑马鱼心脏左右不对称发育相关。酵母双杂交、亚细胞定位和免疫共沉淀分析表明，Pygo1基因可能通过与 ANKRD1基因相互作用来抑制斑马鱼心脏标志基因dHand表达，最终调控心脏左右不对称发育过程。国际上尚无Pygo1基因心脏功能的研究报道。因此，本项目拟进一步利用模式生物斑马鱼和细胞模型，采用Morpholinos干扰、rescue拯救、体外注射过表达及转基因斑马鱼等技术，深入研究Pygo1基因与斑马鱼心脏左右不对称发育信号途径的关系。研究结果将对最终揭示脊椎动物心脏发育的复杂分子机制、先天性心脏病发生的分子机理具有重要的理论意义。

心脏左右不对称发育是斑马鱼心脏发育过程中的关键阶段，与成体心脏功能及心脏发育畸形密切相关。本课题以斑马鱼作为模式动物，首先通过原位杂交技术对斑马鱼Pygo1基因在 5-8，15-18， 22， 25体节的表达进行了研究，Pygo1基因特殊的表达模式证明其可能与左右不对称发育有关，同时也和心脏发育有关。利用Tg:NPPA以及Tg (cmlc2::dsRed2-nuc)转基因斑马鱼的胚胎为材料，注射Pygo1 Morphoinos证明Pygo1能够调控野生型斑马鱼心脏左右不对称发育。bmp4以及myl7原位杂交实验结果显示Pygo1影响斑马鱼心脏前体细胞的迁移过程，导致心脏前体细胞迁移出现紊乱。左右不对称发育标志基因（如spaw、lefty1、lefty2等）检测，证明Pygo1能够调控左右不对称发育标志基因的表达，当过表达Pygo1以及敲减Pygo1的时候都能使左右不对称发育标志基因表达发生紊乱；将Pygo1 mRNA与Pygo1 Morpholinos共同注射到斑马鱼胚胎以后，能够拯救突变表型。双色原位杂交实验表明Pygo1和Nodal信号途径的关键调控因子Charon在库氏泡(Kupffer's Vesicle)共同表达，在Pygo1过表达以及敲减Charon的时候都能够导致左右不对称发育紊乱、微管蛋白的动态组装异常、出现两个类似库氏泡的结构，Pygo1可能和Charon拮抗地调控左右不对称发育；最后通过体内Co-IP实验证明Pygo1能够直接与Charon相互作用，并且通过抑制Charon调控库氏泡的发育。该研究项目结果表明Pygo1可能是连接Wnt信号途径与Nodal信号途径的一个关键“结点”，在它们之间起着重要的交互作用。