异氟烷预处理骨髓间充质干细胞促进其存活和靶向归巢的机制研究

Cerebral ischemia stroke is a major cause of morbidity and mortality worldwide.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) therapy is a promising strategy for the treatment of ischemia stroke. However, the cell survival and homing are poor after transplantation, thereby hindering their therapeutic efficacy.Indeed, different studies performed in solid organs showed that more than 80%-90% of grafted cells die within 72 hours after injection. It was reported that ex vivo hypoxia preconditioning enhanced BMSCs survival and homing by SDF-1/CXCR4 pathway upregulation via activating of HIF-1α. We have previously shown that isoflurane preconditioning can upregulate HIF-1α expression in neuron. Furthermore, our preliminary experiment result suggested that isoflurane preconditioning up regulated BMSCs to express CXCR4 and SDF-1. These experimental results leading us to the hypothesis that isoflurane preconditioning may enhance the therapeutic potential of BMSCs by HIF-1α- SDF-1/CXCR4 pathway. Therefore, we will use immunohistochemisty, flow cytometry, real time PCR, western blot and RNA interfere method to test the hypothesis through ex vivo and in vivo experiments. We also would like to analysis the intracellular signaling pathway. The result of current study may provide a novel idea for enhancing BMSCs therapy potential in ischemia stroke treatments.

骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植治疗缺血性脑损伤存在移植细胞生存率低、归巢少的问题。低氧预处理BMSCs可以通过HIF-1α激活SDF-1/CXCR4信号通路促进干细胞存活和归巢。我们前期研究发现异氟烷预处理可诱导神经元表达HIF-1α，预实验也提示异氟烷预处理可上调BMSCs表达CXCR4和SDF-1，故推测异氟烷预处理BMSCs可能通过HIF-1α途径激活SDF-1/CXCR4信号通路，从而促进移植细胞存活和归巢。为此，我们拟通过体外培养大鼠BMSCs并给予异氟烷预处理以及体内建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，运用免疫组化、流式细胞术、real time PCR、western blot、RNA干扰等实验手段分析异氟烷预处理对BMSCs生物学特性变化的影响及对促进BMSCs存活、归巢进而改善移植效果的作用，并深入探讨可能的信号机制，为提高BMSCs移植治疗缺血性脑损伤的疗效提供新思路。

研究显示异氟烷预处理对局脑和全脑脑缺血再灌注损伤以及离体培养的神经元细胞均具有保护作用。以往研究还证实缺血再灌注损伤注入BMSCs可以穿过血-脑脊液屏障，到达损伤后的脑实质，促进神经功能恢复。我们通过离体和在体的实验，得出以下重要结果：1）低浓度的情况下异氟烷预处理上调了CXCR4 mRNA和蛋白的表达量，而在超过一定的浓度之后，进一步提高异氟烷的浓度反而抑制了CXCR4 mRNA和蛋白的表达；异氟烷预处理对CXCR4 mRNA和蛋白的表达量的上调作用随预处理时间的延长而加强，在大约4小时作用达到最大值，之后随着作用时间的延长而趋于减弱。2）Transwell实验迁移细胞计数的结果和抗凋亡试验的结果提示低浓度短时间的异氟烷预处理有助于提升BMSCs细胞的活力，促进其迁移。异氟烷预处理具有细胞保护和细胞毒性双重作用。3）异氟烷预处理和DMOG处理可以使CXCR4的表达量上调，但这一上调在HIF-1α的表达敲低后被抑制了。同时，我们也证实了异氟烷预处理BMSCs上调CXCR4表达能被PI3K/Akt通路的抑制剂所阻断。上述工作阐述了HIF-1α在异氟烷预处理机制中的作用，研究结果表明异氟烷可能通过调控PI3K/Akt信号通路和HIF-1α的表达从而调控CXCR4等关键细胞因子受体的表达对BMSCs的活性产生影响。4）我们通过建立大鼠MCAO局灶性缺血再灌注损伤模型来研究麻醉剂异氟烷预处理在提高BMSCs靶向归巢能力，提高移植疗效中的作用。改良神经功能缺损程度评分结果显示异氟烷预处理BMSCs治疗较BMSCs单纯治疗组神经功能缺损状况明显减轻。Foot-fault评估运动协调能力结果同样显示预处理组大鼠的评分显著高于BMSCs单纯治疗组。行为学评价后处死大鼠，对大脑梗死灶进行BrdU免疫组织化学染色，对各组BrdU阳性细胞数目进行计数。与改善结果一致的是，异氟烷预处理BMSCs治疗组与BMSCs单纯治疗组及对照组相比，梗死灶周围的BrdU阳性细胞数也显著增多，即BMSCs向损伤组织移植能力显著提高。我们的结果表明异氟烷预处理BMSCs治疗组较单独应用BMSCs治疗组更能显著促进神经功能症状的恢复，改善运动协调能力。