七鳃鳗核转录因子（NF-кB）在TLR信号通路介导的先天性免疫应答中的活性及其机制的研究

As critical link stages between invertebrates and vertebrates, lamprey provides rich genetic information for the vertebrate origin and evolution. Nuclear factor of kappa B (NF-кB), the crucial nuclear transcription factor participating in TLR signaling pathways, involves in the immune response and classical biological processes by regulating the expression of a diverse array of genes. Although many researches have been done on NF-кB, little was known about the activities and mechanism of NF-кB in lamprey. Our previous research has found that there were significant immune responses of NF-кB and IкB-ε-like to LPS stimulation. Also, our in vitro studies have shown that lamprey NF-кB not only interact with DNA but modulate gene expression. This project intends to use methods such as lentiviral transfection, CRISPR-Cas9 knockout, and ChIP-Seq to investigate the activities and mechanism of NF-кB on the innate immune response, and confirm the target genes of NF-кB in lamprey. This study will not only establish the theoretical base for realizing the innate immune response mediated by lamprey TLR signaling pathway, but also provide more ideas and references for the researches on the evolutionary origin of vertebrate immune system.

七鳃鳗作为联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要阶元，为研究脊椎动物的起源与进化提供丰富的遗传信息。NF-кB是TLR信号通路中重要的核转录因子，通过调控基因的表达参与免疫反应等多种经典的生物进程。虽然NF-кB已经被较为广泛的研究，但是其在七鳃鳗中的活性和作用机制还未得到全面阐述。申请人首次发现七鳃鳗NF-кB和IкB-ε-like能够对LPS产生明显的免疫应答。体外实验也显示七鳃鳗NF-κB不仅能够结合DNA，还能够调节基因的转录。本项目拟以七鳃鳗为研究对象，通过慢病毒转染，CRISPR-Cas9基因敲除和ChIP-Seq等技术，探讨NF-кB在七鳃鳗先天性免疫应答中的活性和作用机制，明确NF-кB直接调控的靶基因。本研究不仅为深入认识七鳃鳗TLR信号通路介导的先天性免疫应答奠定理论基础，同时也为脊椎动物免疫系统的进化研究提供更多的思路与参考。

NF-κB（Nuclear Factor-κB），NFAT （Nuclear factor of activated T cells）和RBP（recombination signal binding protein）都属于RHR（Rel homology region）转录因子超家族成员。该转录因子家族成员能够通过调控基因的表达，来参与不同方面的免疫应答反应。为了进一步明确七鳃鳗NF-κB的进化起源，所有RHR家族成员的系统发育树被构建。进化分析显示，RHR 家族成员随着物种演化，通过基因的复制、突变和沉默，不断分化出新型同源基因的同时也伴随着基因的丢失。Motif，基因结构和三级结构分析表明RHRs基因在进化上是保守的，并且都含有RHD和IPT结构域。此外，同线性分析显示与高等脊椎动物相比，七鳃鳗RHRs基因在染色体上的相邻基因经历了显著的变化。实时定量PCR实验和双荧光素酶报告实验结果都显示七鳃鳗RHRs基因在免疫应答的调节中扮演了重要的角色。通过转录组分析，筛选出了七鳃鳗NF-κB的一些关键靶基因。本研究不仅为深入认识七鳃鳗转录因子介导的先天性免疫应答奠定理论基础，同时也为脊椎动物免疫系统的进化研究提供更多的思路与参考。