第三内含子+11 G>A SNP对hURAT1结构和功能的影响

hURAT1是原发性高尿酸血症的重要候选基因，其突变或SNP与血尿酸水平密切相关。申请者发现，hURAT1基因第三内含子区存在+11 G>A SNP，该SNP使第五外显子mRNA完全缺失，与高尿酸血症关联密切。据此推测：hURAT1基因第三内含子 +11 G>A SNP影响hURAT1 的结构和功能。本研究拟通过下列实验进行验证（1）应用原核表达系统，获得hURAT1重组蛋白，构建脂质体，应用膜片钳技术检测基础和刺激状态下重组蛋白转运尿酸能力，探讨第五外显子缺失对hURAT1活性的影响（2）将转染hURAT1 cDNA的卵母细胞置于含14C-尿酸盐溶液中培养，观察第五外显子缺失对hURAT1功能和细胞内定位的影响（3）制备和纯化hURAT1蛋白晶体，通过X-射线衍射，观察第五外显子缺失对hURAT1结构的影响。该研究对深入了解原发性高尿酸血症遗传易感性及该病的早期预测和预防均具有重要意义。

hURAT1是原发性高尿酸血症的重要候选基因，其突变或SNP与血尿酸水平密切相关。课题组发现，hURAT1基因第三内含子区存在+11 G>A SNP，该SNP使第五外显子mRNA完全缺失，与高尿酸血症关联密切。hURAT1基因启动子区-87C/T SNP与原发性高尿酸血症相关，且该SNP可导致基因转录活性改变。据此推测：hURAT1基因第三内含子 +11 G>A 及启动子区-87C/T SNP影响hURAT1 的结构和功能。本研究通过下列方法，对上述问题展开研究：以hURAT1的野生型和突变型重组载体瞬时转染真核细胞293T后，比较各组细胞mRNA表达情况；以反转录的hURAT1的cDNA为模板分别构建野生型、突变型和第5外显子缺失型质粒，并分别以三组质粒为模板合成mRNA，显微注射入斑马鱼胚胎卵黄中。通过激光共聚焦扫描显微镜，观察不同基因型的hURAT1的亚细胞定位。标记包含-87C/T SNP不同等位基因型的探针，运用EMSA实验观察两种等位基因型探针蛋白结合情况。结果发现：与野生型相比，hURAT1基因第3内含子+11G>A SNP 突变型重组质粒在293T细胞内转录后，同时表达两种mRNA剪接体。一种为hURAT1的野生型mRNA，另一种为hURAT1第5外显子完全缺失的mRNA。亚细胞定位研究表明，hURAT1野生型蛋白在细胞膜上有明显的富集，细胞质中呈点状分布；hURAT1突变型和第5外显子缺失型蛋白均弥散的存在于细胞质中，而在细胞膜上无表达。因此得出结论：体外功能研究证实，hURAT1基因的第3内含子+11G>A SNP导致该基因的mRNA转录出现可变剪接，导致第5外显子完全缺失，产生hURAT1剪接异构体，改变了hURAT1蛋白结构并影响其亚细胞定位。hURAT1 基因启动子区-87C/T SNP与山东汉族男性痛风相关；该SNP转录活性存在差异，是致病位点，该差异可能由GR转录因子通过CREB介导完成。该研究对深入了解原发性高尿酸血症遗传易感性及该病的早期预测和预防均具有重要意义。