TMEM64调节的cAMP在维甲酸诱导急性早幼粒白血病细胞分化中的作用及机制

All-trans retinoic acid (ATRA) is the first differentiation-inducing agent for curing acute promyelocytic leukemia (APL). However，partial APL patients still are resistant to ATRA, deficient cAMP is one reason of retinoic acid resistance, but its mechanism of cAMP generation induced by ATRA remains unclear. In previous work, we discover that TMEM64 could promote APL cell differentiation and cAMP generation induced by ATRA. This investigation takes APL cell lines and patients’ primary cells as research subjects. Through overexpressing or interfering with TMEM64 by lentiviral vector, we intend to investigate the effects of TMEM64 on cAMP generation and cell differentiation induced by ATRA in APL cells, and to confirm the biological functions of TMEM64 in APL primary cell. By studying the effects of TMEM64 on calcium signal, SERCA activity, CaMK activity, cAMP generation, and then studying the bind capacity between TMEM64 and ATRA which activates G protein and PLCβ signal pathway, it could reveal the molecular mechanism of cAMP generation and APL cell differentiation induced by ATRA. This project could provide theoretical and experimental basis for APL individualized treatment and drug resistance study.

全反式维甲酸是第一个治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的诱导分化药物，然而仍有部分APL病人对维甲酸耐药，cAMP缺失是其耐药原因之一，但维甲酸诱导APL产生cAMP的机制尚不清楚。在前期工作中，我们发现TMEM64可促进维甲酸诱导APL细胞产生cAMP和细胞分化。本研究拟以APL细胞株和患者原代细胞为研究对象，通过慢病毒干扰或过表达TMEM64，研究TMEM64在维甲酸诱导APL细胞产生cAMP和细胞分化中的作用，以及在维甲酸敏感和耐药的APL患者细胞中证实TMEM64的生物学作用。通过研究：1）TMEM64对内质网钙离子信号、SERCA活性、CaMK活性、cAMP产生的影响；2）TMEM64与维甲酸之间的结合，以及TMEM64在维甲酸诱导的G蛋白和PLCβ活化中的作用，拟揭示维甲酸诱导cAMP产生和细胞分化的分子机制，为耐药APL患者提供个体化的治疗和耐药机制研究奠定理论和实验基础。

全反式维甲酸（ATRA）是治疗急性早幼粒白血病（APL）的一种有效药物，研究表明ATRA诱导APL细胞分化与胞内cAMP的升高密切相关，虽然ATRA可以使约90%的APL患者缓解，但仍有部分APL患者对ATRA耐药或治疗缓解后复发，cAMP信号产生障碍可能是其原因之一。本课题通过全基因组芯片筛选发现TMEM64在ATRA敏感的NB4细胞中表达高于对ATRA耐药的NB4-R1细胞，进一步发现TMEM64可以激活CRE（cAMP response element）报告基因，提示TMEM64可以促进APL细胞内cAMP的产生。利用慢病毒构建干扰TMEM64的稳定株NB4-siTMEM64，我们发现干扰TMEM64表达后，ATRA诱导的NB4细胞分化受到了抑制，而且诱导产生的cAMP也明显减少。研究发现内质网膜TMEM64可以与SERCA2（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2）相互作用，调节内质网内钙库的储存，有利于促进ATRA诱导的胞内钙离子流的升高，从而激活CaMKII，引起cAMP升高和NB4细胞分化。此外我们也发现ATRA可以激活PLCβ，经由PLCβ-IP3-Ca2+途径激活CaMKII。在APL患者细胞中我们也发现，ATRA治疗缓解的APL患者细胞中的TMEM64 mRNA、cAMP均比复发的APL患者细胞中的表达高，二者存在正相关性。综上所述，我们的研究发现ATRA可以通过PLCβ-IP3-Ca2+-CaMKII途径上调NB4细胞内cAMP表达，进而诱导细胞的成熟分化，ATRA激活的这一钙信号途径受到内质网膜TMEM64的正调节，因此TMEM64的表达有利于ATRA诱导的APL细胞的分化。通过本课题的研究，在一定程度上阐明了维甲酸诱导APL细胞cAMP产生和细胞分化的分子机制，为ATRA敏感和耐药的APL患者的鉴别和治疗奠定基础。