肌糖蛋白-C III型纤连蛋白结构域重复序列D在人骨肉瘤中的表达及其在骨肉瘤转移中的作用

骨肉瘤早期肺转移是常见的临床现象。细胞外基质成员肌糖蛋白C（TN-C）在肿瘤转移中起重要作用，在制备了抗TN-C CIII型纤连蛋白结构域重复序列D（fnD）单抗的基础上，我们发现发生骨肉瘤肺转移患者组织和血清标本中fnD表达明显升高；胰岛素样生长因子-I（IGF-1）和表皮生长因子（EGF）协同诱发骨肉瘤细胞fnD表达。本研究拟将骨肉瘤细胞进行fnD RNA干涉后加入IGF-1和EGF或者将fnD基因转染入骨肉瘤细胞后，分别在培养体系中加入fnD拮抗性肽段、特异性单抗或者fnD配体封闭性单抗，判定肿瘤迁移能力改变。同时构建裸鼠异体种植转移模型，将骨肉瘤细胞进行类似处理，观察fnD表达对骨肉瘤转移的影响。本课题将对明确TN-C fnD片段对骨肉瘤转移的影响，阐明IGF-1和EGF促骨肉瘤转移的机理，及为探索有效临床治疗的手段提供有益的思路。但其在骨肉瘤发病过程中的表达调变和作用尚不明确。

本项目在前期研究的基础上拟建立3D体外培养体系，模拟体内骨肉瘤细胞的生长转移。并构建肌糖蛋白-C III型纤连蛋白结构域重复序列D（TN-C fnD）过表达载体或特异性siRNA并转染细胞，在3D培养系统中检测TN-C fnD过表达或缺失表达对骨肉瘤细胞生长和迁移的影响。同时构建裸鼠移植瘤模型，将上述细胞移植至裸鼠腋下，在体检测TN-C fnD过表达或缺失表达对肿瘤生长、血管再生和侵袭的影响。本项目获得的主要结果有：1.制备了TN-C的单、多克隆抗体，并对多克隆抗体进行了HRP标记、建立了ELISA检测方法（灵敏度为400pg/mL）。2. 利用不同的信号通路抑制剂处理骨肉瘤细胞，发现IGF-1、EGF和机械力促骨肉瘤转移主要依赖RhoA/ROCK信号通路。3.建立了基于旋转生物发生器的3D细胞培养方法，在体外检测了骨肉瘤细胞中TN-C fnD的表达形式，同时发现细胞外基质蛋白和MMP家族成员（MMP-1，MMP-2，MMP-9）的表达都有明显的上升。 4.构建TN-C fnD过表达或特异性缺失的骨肉瘤MG-63细胞，并用3D体外培养体系检测骨肉瘤细胞迁移能力的变化，发现与正常的骨肉瘤细胞相比，TN-C fnD过表达能显著促进骨肉瘤细胞的转移；而TN-C fnD缺失的MG-63细胞其转移能力显著降低。5.建立骨肉瘤裸鼠模型，将不同的骨肉瘤细胞种植于裸鼠后，观察到TN-C FnD过表达MG-63组及对照正常MG-63较TN-C FnD缺失表达的MG-63组肿瘤生长、转移都较快。研究利用体外细胞模型和在体动物模型证实了在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞中TN-C FnD的高表达，及其对骨肉瘤转移的促进作用。本项目的研究成果明确了TN-C fnD片段对骨肉瘤转移的影响，为以TN-C为靶点治疗骨肉瘤提供了研究基础，为探索有效临床治疗的手段提供有益的思路。