ONZIN促进骨肉瘤转移的机制研究及其在肿瘤免疫功能中的作用

Osteosarcoma is the most common malignant bone tumor with high lung metastasis and poor prognosis. However, mechanism of osteosarcoma metastasis is poorly studied. Our preliminary studies showed ONZIN overexpression enhanced proliferation, migration and soft-agar colony formation of osteosarcoma cells, demonstrating ONZIN is closely related to osteosarcoma metastasis. Our Initial studies on molecular mechanisms revealed that ONZIN overexpression activated MAPK/ERK pathway in two distinct ways: 1) forming a protein complex with C/EBPβ to induce promoter methylation of DUSP6 (a MAPK phospholipase); 2) Inducing CXCL5 expression. However, further mechanistic research of ONZIN overexpression in osteosarcoma metastasis is warranted, and whether ONZIN overexpression has any clinical relevance is not clear. Thus, we propose to use cell culture, orthotopic osteosarcoma model, Onzin transgenic mouse model and clinical patient samples to test the following hypotheses: ONZIN overexpression increases DUSP6 promoter methylation, inhibits its expression, leads to increased ERK1/2 phoshorylation; ONZIN also induces CXCL5 overxpression and secretion, increases neutrophil recruitment to the tumor, and promotes cancer cell proliferation, invasion and metastasis. Therefore the proposal may provide theoretical foundation of ONZIN as a new biomarker and therapeutic target for osteosarcoma.

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，具有高肺转移率且预后差的特点，其转移机制尚不明确。预实验发现，过表达ONZIN促进骨肿瘤细胞增殖，提高其迁移能力和克隆形成，证明ONZIN高表达与骨肉瘤发展转移密切相关。本项目前期机制研究表明ONZIN可通过两种途径激活MAPK/ERK通路：1）与C/EBPβ等蛋白形成复合物诱导MAPK磷酸酯酶DUSP6的启动子甲基化；2)诱导CXCL5的表达。但ONZIN调控骨肉瘤转移的机制及其临床意义尚需进一步探索。为此申请人提出利用细胞培养，原位骨肉瘤肺转移模型，OZNIN转基因鼠模型结合临床样品验证以下假说：ONZIN高表达促进DUSP6启动子甲基化，导致其表达沉默，提高ERK1/2磷酸化；同时ONZIN诱导CXCL5的表达和分泌，介导骨肉瘤内嗜中性粒细胞的浸润，促进肿瘤细胞增殖和侵袭，导致骨肉瘤的转移。该研究将为ONZIN作为骨肉瘤的分子标志和治疗靶基因提供理论基础。

目的：ONZIN已被证明在多种肿瘤进程中发挥重要作用，我们前期研究也发现ONZIN促进骨肉瘤细胞的增殖及转移，然而，ONZIN促进骨肉瘤恶性进展的深层机制仍有待挖掘。本研究旨在进一步探讨ONZIN促进骨肉瘤恶性进展的作用机制，为骨肉瘤临床诊疗提供分子标志和治疗靶标。.方法：利用RT-qPCR、Western blot及IHC实验检测OS临床标本、组织芯片、人OS细胞系中ONZIN的表达水平。通过RNA-Seq及生信分析，寻找ONZIN下游靶基因，并对差异基因进行通路富集分析。利用CCK-8, 克隆形成, transwell以及划痕实验验证ONZIN及其下游分子对OS细胞增殖和迁移能力的影响。利用双荧光素酶报告基因实验、定点突变等实验探究ONZIN促进骨肉瘤恶性进展的分子机制。最后，构建皮下成瘤模型、胫骨原位瘤模型和尾静脉注射肺转移模型，通过病理组织切片HE染色、免疫组化等明确ONZIN及其下游分子对于OS进展的影响。.结果：ONZIN在OS组织和细胞中高表达，ONZIN高表达的OS患者临床分期较差。敲低ONZIN的表达可抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结合RNA-seq数据分析显示，ONZIN可通过下调DUSP6的表达激活MAPK/ERK信号通路进而促进OS恶性进展。通过公共数据库筛选及双荧光素酶报告基因等实验证实ONZIN可上调miR-181a-5p表达，从而抑制DUSP6的mRNA，来激活MAPK/ERK信号通路。同时，生信分析结果显示，ONZIN与多种趋化因子表达呈正相关。其中，ONZIN能够通过下调miR-363-3p促进CXCL5的表达及分泌进而影响OS的恶性生物学行为。最后，我们利用体内外研究证实了上述机制。.结论及意义:本研究证明了ONZIN在OS组织和细胞中上调，且其表达与肿瘤分期密切相关。ONZIN可通过两条途径促进OS恶性进展：1) 通过miR-181a-5p下调 DUSP6进而激活MAPK/ERK信号，促进OS进展；2) 通过下调miR-363-3p诱导CXCL5的表达促进OS的进展。ONZIN或可作为OS新的治疗靶点，为OS的临床治疗提供新思路。