沉香色酮合成途径中关键聚酮环化酶基因的挖掘及调控机制研究

As the Traditional Chinese Medicine and natural spice, agarwood is the fragrant natural product from trees of the Aquilaria genus of Thymelaeaceae family. The research about agarwood mainly focus on the chemical constituents, pharmacological activites and artificial induction technology, while the molecular mechanism of agarwood formation remain unknown. 2-(2-phenylethyl) chromones are the characteristic constituents of agarwood and their contents are closely related with quality of agarwood, whereas the biosynthesis mechanism of 2-(2-phenylethyl) chromones are still unclear. In our previous studies, biosynthesis pathway of 2-(2-phenylethyl) chromones have been deduced based on transcriptome and metabolomics data before and after agarwood formation. We found that polyketide cyclase (PKC) is one of the key enzymes in biosynthesis of 2-(2-phenylethyl) chromones, which most likely to catalyze 2-(2-phenylethyl) chromones formation from the linear intermediate 1,5-diphenyl-1,3-pentanedione by cyclization reaction.The 7 PKC genes closely related with 2-(2-phenylethyl) chromones accumulation have been cloned. In this study, we will identify PKC and their alternative splicing genes, which play an key role in 2-(2-phenylethyl) chromones formation, eventually their function and molecular regulatory mechanism in 2-(2-phenylethyl) chromones synthesis will be further studied and verified. The implementation of this project will contribute to further research on 2-(2-phenylethyl) chromones biosynthesis and agarwood formational mechanism, and also provide the theoretic foundation for the research and development of artificial induction technology of agarwood.

沉香是瑞香科沉香属植物受伤后产生的含树脂的木材，是传统的名贵药材和天然香料。目前对沉香的研究集中在化学成分和药理活性以及人工诱导结香技术等方面，而沉香形成的分子机制还不明确。2-（2-苯乙基）色酮类化合物是沉香的特征性成分，其含量高低与沉香品质密切相关，但其生物合成机制研究鲜有报道。项目组前期研究中结合沉香植物结香前后的转录组和代谢组数据推导出2-(2-苯乙基)色酮类化合物生物合成途径，发现聚酮环化酶（PKC）是该途径的关键酶之一，主要催化链状的1,5-二苯基-1,3-戊二酮环化形成2-（2-苯乙基）色酮，并筛选得到与色酮积累相关的7个PKC基因。本项目将在此基础上通过分子生物学和化学结构分析的方法挖掘2-(2-苯乙基)色酮合成相关的聚酮环化酶基因及其可变性剪切，并对其功能及调控机理进行研究，为进一步揭示沉香色酮生物合成途径和沉香形成机制奠定基础，也将为建立高效的人工结香技术提供理论依据。

沉香是瑞香科沉香属植物受伤后产生的含树脂的木材，是传统的名贵药材和天然香料。目前对沉香的研究集中在化学成分和药理活性以及人工诱导结香技术等方面，而沉香形成的分子机制还不明确。2-（2-苯乙基）色酮类化合物是沉香的特征性成分，其含量高低与沉香品质密切相关，但其生物合成机制研究鲜有报道。. 我们首次发布了白木香染色体水平基因组组装和基因注释结果。该基因组精细图谱的发布将为野生沉香种群保护生物学、沉香结香机制和香味基因及树种的进化研究奠定良好基础，也为进一步基于基因组的功能基因的挖掘提供了可能。. 从白木香基因组中挖掘了25个聚酮环化酶基因，根据茎干与叶的组织表达差异，以及诱导剂处理前后的表达差异，筛选了聚酮环化酶基因AsPKC1进行功能验证。通过体外构建异源表达载体和体外诱导分离纯化得到了AsPKC1融合蛋白。以水杨酸CoA和β-酮酸为底物用AsPKC1 进行体外催化，与对照组相比实验组催化产生了相对分子质量为284、271 和285 的化合物，与2-(2-苯乙基)色酮结构不一致，其结构未能鉴定。. 根据PKS 保守结构域，从白木香基因组中鉴定出11个AsPKS 基因。用AsPKS01 融合蛋白催化底物苯丙酰辅酶A、丙二酰辅酶A 和2-羟基苯甲酰辅酶A，进行体外酶功能鉴定，通过HPLC-MS 检测到反应体系中产生了相对分子质量为352 的化合物，其结构未能鉴定。. 经烟草瞬时表达实验，在分别转入AsPKS01、AsPKS04基因的烟草叶片中加入苯甲酰辅酶A之后，用甲醇提取叶片，获得了分子量分别为250、280和297的2-(2-苯乙基)色酮化合物峰，初步验证了AsPKS01、AsPKS04的功能。. 利用结香剂诱导白木香结香前后的转录组数据，并结合白木香全基因组序列，鉴定得到62个bZIP转录因子，通过转录组数据的表达量变化筛选出9个与沉香色酮、AsPKS表达量高度相关的AsbZIP基因进行后续功能鉴定。9个bZIP定位细胞核内，酵母单杂交和荧光素酶报告实验发现了24对白木香bZIP与PKS的相互作用，包括12个抑制作用以及12个促进作用。