利用多肽修饰的无镉量子点作为荧光探针研究CXCR4在细胞膜上的运动

CXCR4是一种与多种疾病相关的G-蛋白偶联受体，是重要的潜在药物靶点。CXCR4在细胞膜上的运动对于实现其功能至关重要，但是目前的研究结果还非常有限。本项目旨在合成InP/ZnS核／壳类无镉量子点作为荧光探针，选择并设计含有半胱氨酸（Cys）的CXCR4的多肽配基，使之既可以直接修饰无镉量子点表面，又可以特异性识别细胞膜或模拟生物膜内的CXCR4蛋白，通过优化量子点的各项光学性质，以及提高多肽修饰效率和修饰后的量子点与蛋白的亲和性，建立起无镉量子点－多肽配基－CXCR4蛋白的新型检测体系，然后利用单粒子示踪法对CXCR4在哺乳动物细胞膜和模拟生物膜内的运动进行表征和比较。通过这一研究，我们不但能够表征CXCR4在细胞膜上的运动特性，为进一步了解该蛋白的功能并对其进行调控提供实验依据，也能够揭示细胞膜和模拟生物膜在生物功能上的异同。这一项目的开展，将为其他膜蛋白的相关研究奠定基础。

荧光纳米探针近年来在生物标记和生物医学诊断领域得到了广泛的应用。然而，目前发展较为成熟的半导体量子点多为含镉量子点，镉离子在生物体内的释放会造成细胞中毒，所以在生物标记和检测方面的应用受到一定限制。本项目原计划制备InP/ZnS核壳量子点， 并对其进行功能修饰作为荧光探针来标记细胞表面的CXCR4量子点。实验过程中我们发现虽然InP/ZnS核壳量子点产品不含镉离子，但是反应物有剧毒，另一方面，产品的荧光特性并不稳定，在进一步的修饰反应中损失很大，所以我们调整方案，制备了水相合成的以乙酰化的半胱氨酸为稳定剂的 CdTe/CdS/ZnS 核/壳/壳量子点，细胞活性实验显示包被后的量子点毒性降低很多，在实验采用的浓度范围内可以很好地满足活细胞实验要求。我们利用EDC/NHS耦合反应引入了在蛋白质分离中常用的N，N-二（羧甲基）-L-赖氨酸 （NTA）来修饰CdTe/CdS/ZnS 核/壳/壳量子点的表面。NTA具有四个和镍离子结合的位点，可以有效地固定镍离子。另一方面，我们利用基因重组表达技术在CXCR4 伸出胞外的N端融合表达一个由10个组氨酸组成的短标签histag，利用Histag和镍离子的配位作用将量子点锚定在膜蛋白上，特异性地荧光标记了活细胞表面的蛋白分子。利用这一方法，我们成功标记了细胞表面表达的具有Histag的CXCR4蛋白，RFP蛋白和β2AR蛋白。然后我们利用全内反射荧光显微镜对蛋白上的荧光量子点进行了跟踪， 通过记录分析单个荧光点的运动轨迹，我们得出COS7细胞表面的CXCR4蛋白的扩散系数约为1x10−13cm2/s。 此外我们还制备了具有绿色荧光的石墨烯量子点（GQD），GQD具有尺寸小，生物相容性好，比表面积高等优点。接有叶酸（FA）的石墨烯量子点可以负载抗癌药物阿霉素（DOX），从而形成抗癌药物组装体DOX-GQD-FA。这种组装体可以选择性地标记HeLa细胞，靶向性地通过受体介导的内吞作用快速进入目标细胞内部并将药物释放，药物和药物载体的位置与细胞内含量可以同时通过共聚焦显微镜的不同监测通道实时追踪检测。体外细胞活性试验表明，DOX-GQD-FA组装体对于目标细胞有显著的毒性，而对于其他非目标细胞无明显的毒性。本项目的研究路线对于构建具有复合功能的生物荧光探针提供了很好的借鉴，所取得的结果为进一步了解膜蛋白的功能并对其进行调控提供实验依据。