脑缺血性卒中后缝隙连接的功能变化及对神经血管单元的影响及机制

进行半暗带的保护可以减小缺血性脑卒中的梗死体积，改善患者预后。而由于脑结构和功能的复杂性，针对由神经元、胶质细胞和血管内皮细胞构成的神经血管单元的综合性保护措施可能具有真正的临床意义。星形胶质细胞上的缝隙连接直接参与代谢底物、损害因子、信号通路、水和离子的转运，对神经血管单元的功能维持具有重要意义。本项目在明确了缺血后缝隙功能变化规律的前期工作基础上，选取甘珀酸抑制缝隙连接功能，采用体内体外实验相结合的设计，研究干预后神经血管单元在脑缺血损伤中的结构及功能变化，分析缝隙连接蛋白Cx43胞内合成及运输的变化机制，以期初步揭示缝隙连接功能变化对星形胶质细胞、神经元和内皮细胞间相互关联的影响及作用机制，为深入认识缝隙连接在缺血性卒中中的作用奠定基础，为挽救半暗带、探索真正具有临床应用价值的神经保护策略提供新的思路。

项目已基本于2013年12月按照计划书的内容完成。.1、明确了干预缝隙连接后神经血管单元在脑缺血再灌注损伤中的结构和功能变化.项目制备了Wistar大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCAO），利用甘珀酸阻断缝隙连接胞间通讯功能，比较了干预组和对照组半暗带内神经血管单元的病理学改变的差异，并比较了两组间梗死体积和神经元凋亡的情况及血-脑屏障通透性的变化。.2、探讨了干预缝隙连接对星形胶质细胞与神经元间相互作用的影响机制.此部分研究从以下方面揭示干预缝隙连接后，星形胶质细胞功能变化对神经元的影响及其机制：.（1）炎性反应：比较干预组和对照组在IL-6、IL-1和TNF-α染色强度上的差异，分析由胶质细胞介导的炎性反应在干预缝隙连接后的变化情况；.（2）氧化应激调节：采用免疫组化法比较两组脂质过氧化产物的差异，并采用Western blot法比较两组间nNOS、eNOS和iNOS的差别，分析生物活性氧自由基及过氧化产物受影响的情况；.（3）ATP的释放：采用化学发光法比较两组间ATP的释放情况。.3、糖氧剥夺/复氧复糖对Cx43分布的影响及机制.前期研究表明，糖氧剥夺/复氧复糖后Cx43的总量并未发生改变。采用激光共聚焦观察Cx43的重新分布，胞膜上分布减少，胞浆内分布增多，间接提示相邻细胞间缝隙连接数量减少、功能下降。此外，胞浆内Cx43免疫荧光大小不等、形状不一，提示胞膜上的Cx43被胞膜内陷包裹，进入胞浆，形成了小囊泡。进而采用Dynasore阻断胞吞作用，发现Cx43仍有从胞膜到胞浆的转移，由此可以推测Cx43重分布的机制除了通过胞吞作用外，仍存在其他途径，如.微管运输、磷酸化改变等。.4、探讨干预缝隙连接对星形胶质细胞与血管内皮细胞间相互作用的影响机制.此部分的研究重点为干预缝隙连接对血-脑屏障通透性的影响机制，从3方面进行：.（1）对紧密连接的影响；.（2）比较两组间MMP9、MMP3表达的变化，评价干预缝隙连接对基底膜的影响；.（3）比较两组间AOP4表达的变化、并探索同为膜蛋白的Cx43的磷酸化改变是否与AQP4具有相关性。.5、RNAi体外抑制Cx43对缺氧再复氧模型的干预.为考察RNAi干预的效果及影响，在以甘珀酸干预为主要手段的前提下，尝试了RNAi体外抑制Cx43对缺氧再复氧模型的干预，并拟在时间允许的情况下，将其列入干预机制的深入探讨。