NRP-1通过VEGF/VEGFR2通路促进肝纤维化血管再生的作用研究

Angiogenesis induced by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSECs) is an important mechanism of liver fibrosis. In the early studies, applicants found that neuropilin-1 (NRP-1) could promote abnormal deposition of fibrous tissue in the fibrotic liver. Moreover, the expression of NRP-1 on HSECs increased significantly and correlated with abnormal liver angiogenesis positively. But the role of NRP-1 modulating angiogenesis in liver fibrosis has not been completely elucidated. It was also reported that NRP-1 contributes to angiogenesis in embryo and tumor tissues, besides the VEGF/VEGFR2 pathway plays an important role in angiogenesis. Applicants present that NRP-1 may promote angiogenesis by the pathway in liver fibrosis. This project aims to employ clinical specimens to verify the correlation of NRP-1, VEGFR2 and angiogenesis, the clinical parameters in the fibrotic patients. Primary HSECs of human and mice will be used to explore the molecular mechanism of NRP-1 -VEGF/VEGFR2, including extracellular and intracellular signaling pathways. Animal models of liver fibrotic mice will be utilized to clarify the role of NRP-1 regulating angiogenesis in liver fibrosis. This study will contribute to the understanding of angiogenesis mechanism, and provide experimental evidences for therapeutic targets of angiogenesis in liver fibrosis.

肝窦内皮细胞（HSECs）异常增殖、血管再生是肝纤维化的重要机制。申请者前期发现，神经纤毛蛋白（Neuropilin-1, NRP-1）可促进肝纤维化肝内纤维组织的异常沉积，肝纤维化肝组织HSECs中NRP-1表达明显升高，并与肝血管异常增生呈正相关，但NRP-1在肝纤维化血管再生中的作用尚不清楚。文献报道，NRP-1可调控胚胎及肿瘤组织血管生成，VEGF/VEGFR2通路在血管再生中发挥重要作用。申请者提出NRP-1可能通过该通路促进肝纤维化血管再生，本研究拟用临床标本验证NRP-1、VEGFR2表达与肝纤维化血管再生及临床指标的相关性；采用人及小鼠原代HSECs探讨NRP-1胞外区、胞内区作用于VEGF／VEGFR2信号通路的分子机制；采用肝纤维化小鼠动物模型阐明NRP-1体内调控肝纤维化血管再生的作用机制。该研究将为肝纤维化血管再生机制提供新观点，并为探索抗肝纤维化治疗提供新靶点。

肝纤维化的发生机制主要包括肝内纤维结缔组织的过度沉积和血管异常再生。我们前期研究发现，神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，NRP-1）在肝纤维化中表达升高并与血管再生密切相关。研究表明，NRP-1可促进肝纤维化纤维结缔组织的异常沉积，同时，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体（VEGF／VEGFR）对血管生成具有关键性调节作用，NRP-1作为VEGF的共受体，在血管生成中发挥着重要作用，但NRP-1是否通过VEGF/VEGFR2通路，调控肝纤维化血管再生及其细胞内信号传导机制仍然不明确。该研究旨在进一步探讨NRP-1在调控肝纤维化血管异常再生的作用及机制。收集肝硬化及正常肝组织，通过IHC染色检测肝组织中NRP-1、VEGFR2，以及血管再生标志物CD31及纤维化标志物α-SMA的表达，结果证明NRP-1、VEGFR2与肝纤维化血管再生程度成正相关。在四氯化碳诱导的（CCL4）C57/BL小鼠肝纤维化模型中，通过HE和Massion染色评价模型组与对照组肝脏纤维化程度，并且通过Western Blot和qRT-PCR检测模型组与对照组NRP-1和VEGFR2,得到相同结论。体外通过NRP-1慢病毒成功转染人原代肝窦内皮细胞（HSEC）和脐静脉内皮细胞（HUVEC），下调和上调NRP-1的表达，通过体外Transwell实验、管腔形成实验和CCK-8增殖实验来测定HSEC和HUVEC细胞的迁移、管腔形成和增殖能力，结果表明 NRP-1能够促进HSEC的成管、迁移，在HSEC血管生成中发挥重要作用。近来有研究发现，在HUVEC中，FAK及其激酶活性能够从转录水平调节VEGFR2的表达。因此，我们利用FAK抑制剂PF573228处理敲低和过表达NRP-1的HSEC细胞，证明NRP-1 通过上调FAK及其激酶活性进一步调节转录和翻译后水平的VEGFR2表达。接下来，通过Western Blot检测VEGFR2下游各种信号分子，确定NRP-1通过VEGFR2依赖性PI3K/Akt通路调节HSEC血管成。最后通过体外组织培养，验证阻断NRP-1功能能够抑制肝组织血管再生和纤维化。总之，NRP-1作为肝硬化治疗的重要靶点，可具有抗血管生成和抗纤维化的双重作用，特别是适用于那些对抗VEGF靶向药抵抗的患者。