纤维连接蛋白EDA片段激活β1整合素通路促进肝纤维化血管再生的作用研究

Angiogenesis induced by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSECs) is an important mechanism of liver fibrosis. We previously found that the expression of extra domain A (EDA) of cellular fibronectin (cFN) was positively correlated with the degree of angiogenesis in liver fibrosis, and recombinant EDA could induce angiogenesis of HSECs. It was also reported that EDA could activate β1 integrin-mediated angiogenesis of tumor cells, however, whether EDA induces β1 integrin-mediated angiogenesis of HSECs in liver fibrosis and its mechanism remain unclear. This project aims to explore the role of EDA -mediated HSEC angiogenesis in liver fibrosis, at first, primary and cell lines of HSECs will be used to study the role of EDA-β1 integrin-mediated angiogenesis of HSECs and identify the key β1 integrin and its cell signaling pathway. Secondly, the EDA-/ - mice, Cre-lox Site mice (hepatic sinusoidal endothelial cell β1 integrin-specific deletion) and other animal models will be utilized to confirm the mechanism of EDA-β1 integrin-mediated angiogenesis. Finally, clinical cases will be applied to verify the relationship between EDA, the key β1 integrin, expressions of signaling molecules and angiogenesis of liver fibrosis, and other clinical parameters. This study will contribute to the understanding of angiogenesis mechanism, and provide experimental evidences for therapeutic targets of angiogenesis in liver fibrosis.

肝窦内皮细胞（HSECs）异常增殖、血管再生是肝纤维化的重要机制。我们前期发现，肝纤维化组织中，细胞型纤维连接蛋白EDA片段表达与血管再生程度呈正相关；重组EDA片段可诱导HSECs血管再生。文献报道，EDA可激活β1整合素诱导肿瘤血管再生，但EDA是否通过β1整合素诱导肝纤维化HSECs血管再生及其机制不清楚。本研究拟探讨纤维连接蛋白EDA片段调控肝纤维化血管再生的作用，首先利用HSECs原代细胞及细胞系，研究EDA片段在β1整合素诱导血管再生中作用，明确关键的β1 整合素分子及信号通路；采用EDA-/-及Cre-lox小鼠（肝窦内皮细胞β1整合素特异性缺失）等动物模型，验证EDA-β1整合素调控肝纤维化血管再生的作用机制；利用临床病例验证EDA、关键β1整合素、信号分子表达与肝纤维化血管再生及临床指标的相关性。该研究将为肝纤维化血管再生机制提供新观点，并为探索抗肝纤维化治疗提供新靶点。

肝纤维化的发生机制主要包括血管再生和肝内纤维结缔组织的异常沉积两个方面。其中，肝内血管再生伴随肝纤维化的整个过程，与肝纤维化的发生、发展密切相关。我们前期研究发现纤维连接蛋白的选择性剪接片段（FN-EDA）在肝纤维化组织中高表达，且在肝纤维血管再生中起重要作用。该研究探讨肝纤维化过程FN-EDA与肝纤维化及血管再生的关系，并进一步探讨其作用机制。通过收集肝硬化及正常肝组织，评估肝脏纤维化及血管再生情况以及FN-EDA的表达。在四氯化碳诱导的（CCL4）C57 / BL小鼠肝纤维化模型，注射单剂量的重组腺相关病毒（AAV）载体来敲低FN-EDA的表达。采用组织学，免疫组织化学，荧光实时定量PCR，蛋白印记等检测FN-EDA对肝纤维化和血管再生的影响。体外研究以证明在肝纤维化血管再生过程中，肝星状细胞（HSC）通过分泌FN-EDA调节HSC和内皮细胞（HUVEC）之间的交互作用。通过siRNA下调FN-EDA在HSC中的表达，用重组质粒上调FN-EDA在HSC中的表达。HSC上清与HUVEC与共培养，通过小管形成和Transwell迁移实验来测试内皮细胞的血管生成和迁移的能力。此外利用一系列β1-偶联蛋白中和抗体研究FN-EDA介导的HSC与HUVEC交互作用的关键受体。研究发现FN-EDA在人肝硬化肝组织及肝纤维化动物模型中高表达，且主要分布在HSCs周围，FN-EDA沉默减少了肝纤维化和体内炎症。另外，FN-EDA的含量与纤维化程度和肝微血管密度成正比。 EDA-AAV9处理的小鼠显示微血管密度和血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）减少。体外实验显示，与FN-EDA下调的HSC相比，内皮细胞的迁移和血管生成能力受到抑制。相应地，HSC中FN-EDA的过度表达促进了共培养后内皮细胞的迁移。 Western印迹显示在过度表达的FN-EDA下内皮细胞内ERK信号通路的激活。此外，FN-EDA诱导血管内皮细胞的血管生成受到α9β1-中和抗体预处理的抑制。研究证明，HSC分泌的FN-EDA作为旁分泌相互作用的潜在介质，与位于内皮细胞上的α9β1-整合素结合，通过ERK信号通路上调VEGF的表达，导致肝血管生成和纤维化增加。