推拉策略促进粗糙脉孢菌转化纤维素生产衣康酸

Neurospora crassa has a clear genetic background and mature molecular manipulation tools. It can secrete many kinds of cellulase which can degrade lignocelluloses. But the research of its application is still relatively few, so it has the value of industrial application research. Itaconic acid is an important raw material for chemical synthesis and chemical production, but one of its current bottlenecks is how to reduce the cost of raw materials. In this study, itaconic acid was produced by converting cheap lignocellulose using N. crassa for the first time. Firstly, promoter optimization will be used to increase the expression of cis-aconitate decarboxylase so as to "pull" the carbon source into itaconic acid. Then the concentration of fermentable sugars in the medium will be enhanced by increasing the expression of related cellulase to "push" more fermentable sugars into the cells. Finally, the optimized strains will be analyzed by metabolomics, and the related regulatory points will be found to guide more glucose to itaconic acid production. This study will lay a foundation for the production of industrial chemicals by N. crassa and provide a new direction for the itaconic acid production. In addition, the study of this system can also provide a reference for the industrial application of other filamentous fungi.

粗糙脉孢菌具有清晰的遗传背景和成熟的分子操作工具，能够分泌多种纤维素酶，降解木质纤维素，但其应用方面的研究还比较少，因此具有工业应用研究的价值。衣康酸是化学合成和化工生产的重要原料，但其目前的生产瓶颈之一是如何降低原料成本。本研究将首次利用粗糙脉孢菌转化廉价的木质纤维素生产衣康酸。首先通过启动子优化提高顺式乌头酸脱羧酶的表达量，从而“拉动”碳源转化为衣康酸。再通过提高相关纤维素酶的表达量来增加培养基中可发酵糖的浓度，从而“推动”更多的可发酵糖进入细胞。最后，利用代谢组学分析优化后的菌株，找到相关调控点，引导葡萄糖更多地流向衣康酸生产。本研究将为利用粗糙脉孢菌生产工业化学品奠定基础，也为衣康酸的生产提供新的方向。另外，该体系的研究也可为其他丝状真菌的工业应用提供参考。

粗糙脉孢菌具有清晰的遗传背景和成熟的分子操作工具，能够分泌多种纤维素酶，降解木质纤维素，但其应用方面的研究还比较少，因此具有工业应用研究的价值。本研究主要对粗糙脉孢菌转化纤维素为衣康酸的过程进行了优化和解析。由于纤维素需要首先降解为单糖，为了推动更多底物碳源进入细胞，需要加强重要纤维素酶组分的表达。分别比较了粗糙脉孢菌4种主要纤维素酶，包括CBH1，GH6-2，GH5-1和GH3-4，以及来源于里氏木霉的外切酶TrCBH2和黑曲霉的β葡糖苷酶AsBGA的表达对纤维素酶活性和衣康酸含量的影响。结果表明，单拷贝表达纤维素酶外切酶CBH2组分可以提高总纤维素酶活性和衣康酸含量，其中表达TrCBH2可以使总纤维素酶活性提高1.08倍，衣康酸含量提高0.65倍。对粗糙脉孢菌表达衣康酸合成的关键酶-顺式乌头酸脱羧酶（CAD）的8种启动子进行评价，结果表明使用小棒蛋白（rodlet protein，NCU08457）启动子Peas和时钟控制蛋白（clock controlled protein CCG-1，NCU03753）启动子Pccg-1表达CAD时的衣康酸产量较其他启动子高。为了进一步提高碳源“拉力”，在粗糙脉孢菌中表达来源于土曲霉的顺式乌头酸转运蛋白MTTA，其衣康酸含量提升到5.8倍。继续在该菌株中分别表达GH6-2或TrCBH2，均能够使其衣康酸的产量提高。在72小时时，PMF-CAD-MttA-GH6-2和PMF-CAD-MttA-TrCBH2的产量分别较PMF-CAD-MttA产量提高了0.50倍和0.78倍。经过筛选，得到菌株衣康酸产量最高为354.08mg/L，较仅表达CAD的菌株产量提升到18倍。对其进行代谢和转录分析，发现其三羧酸循环和氧化磷酸化途径被弱化，三种裂解性单加氧酶（LPMOs）的转录水平提高。分析原因可能是合成衣康酸使得三羧酸循环产能降低，菌体为了平衡纤维素降解和自身代谢，对纤维素酶组分进行了调整以适应衣康酸的合成。本研究通过对纤维素酶降解和糖转化生成衣康酸过程进行分别优化和叠加优化，表明其均能促进衣康酸的合成，但对糖转化的优化效果更加明显。同时通过组学分析，阐明了菌株通过自身调节纤维素酶组成和糖代谢来适应合成衣康酸的过程，为日后丝状真菌一步转化纤维素为衣康酸或其他代谢物提供参考。