粗糙脉孢菌锌指转录因子CEA-1调控纤维素酶表达的分子机制

Filamentous fungi are the major microbial producers of lignocellulolytic enzymes in industry. However, mechanism of gene regulation of cellulase expression in filamentous fungi is still far from being completely understood. We recently found a novel regulatory factor (named as CEA-1) affecting the production of cellulases by screening mutant library. So this project will focus on the regulation mechanism of this transcriptional factor. Compared the transcriptional profilings of WT and Δcea-1 grown on different induced conditions, the target genes of this transcriptional factor could be identified. And the binding motif could be aslo obtained. Meanwhile, the relationship between this factor and the other known factor genes invovled in lignocellulolytic enzymes expression could be elucidated. The characterization of this novel transcription factor could be beneficial for scientific understanding of the regulation mechanism of lignocellulolytic enzymes expression in filamentous fungi. It could also provide new cost-effective strategies for biomass degrading enzymes production.

丝状真菌是纤维素酶主要的工业生产菌株，然而丝状真菌中纤维素酶表达调控网络的分子机制非常复杂，远远没有阐释清楚。近期我们通过筛选模式纤维素降解真菌粗糙脉孢菌C2H2锌指转录因子突变体库，发现缺失一个新转录因子（命名为CEA-1）将显著降低纤维素酶的表达水平。本项目将重点针对转录因子CEA-1，通过分子遗传学、转录组学等手段，确定CEA-1下游调控基因及其作用位点，同时结合CEA-1与已知关键转录因子组合突变体和过表达突变体，解析CEA-1与已知调控元件的相互关系。CEA-1作为脉孢菌纤维素酶系表达调控网络中的新元件，其分子功能的解析，对阐明丝状真菌纤维素酶系表达调控的机理、提高工业菌种发酵水平都有着重要的意义。

本项目通过筛选粗糙脉孢菌C2H2家族转录因子单基因突变体，获得了影响纤维素酶表达的新型转录因子CEA-1，并对其分子功能进行解析。利用分子遗传学、生物化学、转录组学等方法，我们发现敲除cea-1基因将导致纤维素酶表达的严重缺陷，突变株的产酶能力仅为野生型菌株的20%，这一表型在另一纤维素降解真菌嗜热毁丝霉中保守存在。此外，突变株菌丝发育异常，伴随大量孢子产生，由此推测CEA-1可能是营养信号传递途径中的重要一环。荧光定位结果表明CEA-1是核蛋白，其活性调控很可能是通过磷酸化来实现的。转录组数据分析显示敲除cea-1会导致纤维素酶基因表达水平的显著下降，相关转录因子的表达水平也受到影响，如：纤维素酶表达抑制子cre-1和res-1分别上调3.6倍和3倍，而纤维素酶特异性调控因子clr-1下调近1倍。随后，我们通过构建多基因突变体证实CEA-1并未直接参与纤维二糖这一信号分子的感应。同时，我们也证实了转录因子CEA-1与碳代谢阻遏调控因子CRE-1在纤维素酶表达调控中存在一定的重叠性，而与CLR-2通路相互独立。此外，转录组数据分析发现非锚定细胞壁表面蛋白基因ncw-1的表达水平也受到CEA-1影响。进一步分析表明NCW-1是纤维素酶表达负调控因子，它可以抑制纤维二糖转运蛋白的表达，进而影响纤维素酶的表达。在完成原定计划的同时，我们还筛选获得了CEA-1上游调控元件丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK-12，并推测STK-12通过磷酸化来降低CEA-1的活性，进而抑制纤维素酶的表达。这些研究结果有利于全面、科学的理解纤维素酶表达调控各个途径之间的相互关系，为纤维素酶高产菌株构建提供新的策略。