Wnt5a在牙乳头分化中的作用及与BMP2的串话

Wnt5a信号转导途径与多种器官的发生密切相关，且参与了多胚层器官发育过程中的上皮间充质相互作用。wnt5a在牙胚发育过程中恒定表达在牙胚间充质中，但其作用机制尚不清楚。我们构建了Wnt5a基因表达病毒载体转染牙乳头细胞，发现Wnt5a信号传导抑制牙乳头细胞的增殖和迁移，促进其分化，提示该信号传导途径与牙乳头的发育有关。本项目在我们已有工作基础上，进一步深入研究Wnt5a在牙乳头分化中的作用。通过建立牙胚间充质Wnt5a条件基因敲除动物模型，观察阻断Wnt5a信号传导对牙乳头发育的影响；采用基因芯片、荧光酶报告基因、Western Blot等方法，研究Wnt5a在牙乳头细胞内的信号转导途径；以JNK和PTEN/AKT通路为切入点，研究Wnt5a与BMP2在牙乳头细胞中的串话机制。本项目的实施有助于揭示Wnt5a信号传导途径与牙乳头发育的关系，对阐明牙齿发育的分子机制有重要的意义。

本研究通过构建Wnt5a过表达重组腺病毒，制备Wnt5a条件培养基（Wnt5aCM），应用Western blot和免疫荧光，研究了Wnt5a是否激活Wnt/β-catenin等信号通路，应用RT-PCR检测与牙胚发育密切相关的核转录因子的表达。通过免疫荧光、细胞粘附实验、细胞划痕及Transwell实验研究Wnt5a对牙乳头细胞（human dental papilla cells, HDPCs）粘附、伸展以及迁移能力的影响。 应用重组蛋白Bmp2和Wnt5a条件培养基刺激HDPCs，通过ALP和茜素红染色检测过表达Wnt5a或（和）Bmp2对HDPCs分化能力的影响，应用RT-PCR和Western blot分析相关基因的表达和信号通路的改变。结果发现：Wnt5a在HDPCs中不促进β-catenin核转位及经典通路的活化。Wnt5a上调DLX1，DLX2，LEF1，MSX2，PAX9，RUNX2 mRNA的表达，下调BARX1、PITX2 mRNA水平，且Wnt5a作用HDPCs后， p42/44 MAPK、P38 MAPK、JNK、AKT通路均活化。Wnt5a可促进HDPCs的早期粘附，促进中期伸展，抑制后期迁移能力。Wnt5a可激活RhoA、JNK通路，提示二者参与Wnt5a对HDPCs粘附、伸展、迁移能力的调节过程。且Wnt5a能部分增强其粘附能力而抑制其伸展、迁移能力。CCK-8和流式细胞术显示Wnt5a基因沉默后，对HDPCs增殖能力无显著作用；Wnt5a基因沉默后，ColI，OC，OPN，DMP1和BSP表达无改变；细胞划痕及Transwell实验显示Wnt5a基因沉默细胞的迁移能力与对照组无差别。体内实验结果显示Wnt5a基因沉默不影响HDPCs形成牙本质基质的量。Wnt5a和Bmp2可协同促进HDPCs的分化，smad4和P38通路被活化。Bmp2通过smad4调控P38的磷酸化，P38的活性又影响Wnt5a的表达和smad1/5的磷酸化；而Wnt5a对Bmp2的促进作用不受smad4和P38的调控。结论：Wnt5a通过Wnt非经典通路促进HDPCs的分化。Wnt5a可促进HDPCs的粘附，伸展但抑制其迁移能力。Wnt5a和Bmp2协同促进HDPCs的分化，smad4和P38在二者串话中发挥重要作用。