蛋白激酶C-δ的促肾间质纤维化作用及其机制的研究

肾间质纤维化(RIF)的机制尚不完全明了。蛋白激酶C-δ（PKC-δ) 可被血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)激活，参与调控缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达，参与某些与上皮细胞-间充质细胞转化(EMT)相关的事件。申请人前期研究发现PKC-δ促进细胞凋亡。RIF与凋亡、EMT等相关。但PKC-δ是否促进RIF，国内外未见报道。本研究在体外用Ang Ⅱ刺激大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞，观察Ang Ⅱ/PKC-δ/HIF-1α信号通路对肾小管上皮细胞EMT的影响，并利用PKC-δ负显性突变株质粒和化学抑制剂Rottlerin阻断该信号通路，抑制EMT；在体内用PKC-δ抑制肽和Rottlerin抑制单侧输尿管梗阻小鼠肾脏PKC-δ活性，减少梗阻后细胞凋亡和EMT，减轻RIF。从而从体外实验和体内实验两方面证实PKC-δ的促RIF作用，阐明其机制，为RIF药物治疗提供新的方向和理论与实验依据。

目的：明确PKC-δ的促肾间质纤维化（RIF）作用和PKC-δ抑制肽δ V1-1和PKC-δ化学抑制剂Rottlerin的抗RIF作用，研究Ang II/ PKC-δ/ HIF-1α促RIF信号通路，以及该通路对肾小管EMT的调控，阐明PKC-δ的促RIF作用机制。方法：在体外，用AngⅡ刺激NRK-52E细胞，RT-PCR、Western blot、免疫荧光等方法观察细胞内α-SMA、E-cadherin、HIF-1α的表达，用Rottlerin抑制PKC-δ活性，以观察AngⅡ/PKC-δ/HIF-1α信号通路对肾小管上皮细胞EMT的影响。在UUO小鼠体内，腹腔注射δ V1-1和Rottlerin，TUNEL染色观察细胞凋亡；Masson’s染色观察纤维化；RT-PCR、Western blot及免疫组化观察EMT标志物α-SMA和E-cadherin的mRNA和蛋白表达；Western blot检测肾脏PKC-δ活性；免疫组化方法观察TGF-β1蛋白表达；观察PKC-δ基因敲除的UUO小鼠和野生型小鼠梗阻后7天和14天肾脏纤维化程度。结果：体外实验： AngⅡ刺激后NRK-52E细胞α-SMA的mRNA和蛋白表达增加，E-cadherin的mRNA和蛋白表达减少，EMT发生。PKC-δ抑制剂Rottlerin可抑制Ang II诱导的EMT。AngⅡ刺激后NRK-52E细胞内HIF1-α mRNA表达升高，Rottlerin抑制其表达。体内试验：TUNEL染色证实梗阻后凋亡，Masson’染色证实梗阻后RIF，免疫组化结果显示α-SMA蛋白表达增加及E-cadherin蛋白表达减少。Rottlerin组、抑制肽δ V1-1组小鼠肾脏组织小管细胞凋亡和RIF程度较UUO组均明显减轻，EMT减少。TGF-β1蛋白表达在各组间无明显差异。PKC-δ基因敲除小鼠UUO后RIF程度较野生型小鼠明显减轻。结论：本研究从体内和体外证实PKC-δ参与RIF的发生和发展，PKC-δ的促纤维化作用是通过促进肾小管上皮细胞EMT实现，可能存在Ang II/ PKC-δ/ HIF-1α促RIF的信号通路，且是一条与经典TGF-β1通路无关的新通路。PKC-δ抑制剂Rottlerin和抑制肽δ V1-1可以抑制上述通路，并最终抑制RIF，为RIF药物治疗提供了新的方向和理论与实验依据。