BAG3在肾间质纤维化中的作用及其机制研究

Renal interstitial fibrosis (RIF) is one of the major pathological changes of end stage renal disease. The main characteristics of RIF included the proliferation of myofibroblast (MFB) and the accumulation of extracellular matrix (ECM). Previous studies have proved the significance of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in tubular epithelia for MFB generation. BAG3 is a member of BAG family with multiple cellular functions. For the first time, we found that BAG3 can promote the EMT of renal tubular epithelia and the ECM production. Using co-IP, we identified that BAG3 directly interacted with Smurf2, a vital regulator for TGF-β1/Smad signaling pathway. TGF-β1 is one of the important histological factors, which can induce the EMT of tubular epithelia and the accumulation of ECM components. These results indicated that BAG3 may regulate TGF-β1/Smad signaling pathway and RIF via interaction with Smurf2. The current project aims to clarify the function of BAG3 in RIF and its potential mechanism. This project may provide potential target for prevention/treatment of RIF.

肾间质纤维化（RIF）是各种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的主要病理改变之一，主要病理特征是肌成纤维细胞（MFB）过度增生活化和细胞外基质（ECM）的过度沉积。大量研究表明MFB主要来源于肾小管上皮细胞发生间充质转分化（EMT）。BAG3含有多个蛋白结构域，具有多种生物学功能。最近我们首次发现BAG3可以促进肾小管上皮细胞的EMT及ECM的生成，并且鉴定出BAG3与TGF-β1/Smad通路的重要调控分子Smurf2直接相互作用。TGF-β1是目前研究最强的致纤维化因子，主要通过TGF-β1/Smad通路促进肾小管上皮细胞EMT及分泌ECM。这些结果提示BAG3可能通过与Smurf2的相互作用，调控TGF-β1/Smad信号通路，进而促进RIF。本项目拟阐明这一科学假设并探讨BAG3在RIF中的作用及机制，该研究成果将有助于我们对RIF机制的理解，为RIF的临床防治提供潜在的研究靶点。

肾间质纤维化即RIF是肾脏病终末期的重要病理改变，上皮细胞间充质转分化（EMT）是RIF发生和发展的重要机制之一，近期的研究揭示了翻译后修饰对于EMT的作用，但是作为翻译后修饰的重要内容，O-GlcNAc糖基化在EMT当中的作用少被提及。为了探讨O-糖基化对RIF的作用，我们以TGF-β1处理HK2细胞，发现在TGF-β1处理下O-糖基化的催化酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT ）的表达增加。进一步研究证实TGF-β1在转录后水平增加OGT的mRNA的稳定性。既往的研究结果提示腺嘌呤甲基化形成6-甲基腺嘌呤（m6A）是最为常见的RNA转录后修饰之一，此过程在甲基化酶及去甲基化酶的作用下达到平衡。我们发现，OGT mRNA 的3'端存在着m6A甲基化的位点，并且荧光素酶检测方法也验证了OGT mRNA 的3'端与其稳定性密切相关。同时我们也检测到在TGF-β1作用下，OGT mRNA的m6A甲基化水平下调，而m6A去甲基化酶-肥胖相关蛋白（FTO）的表达水平增高。在HK2细胞中，敲除了FTO后， TGF-β1下调OGT mRNA的m6A甲基化水平的作用消失。所以，我们的上述结果提示TGF-β1处理增加了FTO的稳定性，FTO通过对于OGT mRNA3'端的m6A去甲基化，稳定其表达，并进一步诱导EMT。同时，我们以葡萄糖胺处理HK2细胞发现O-糖基化产物表达上调的同时细胞发生了EMT。当敲除OGT之后，不但降低了O-糖基化蛋白水平，也抑制了EMT的发生，蛋白质谱分析的结果显示RAF激酶家族成员之一，RAF1是O-糖基化蛋白之一，并且S227位点为RAF1的糖基化位点，进一步的试验证明了葡糖胺通过S227位点的O-糖基化抑制了RAF1在泛素蛋白酶体途径的降解来稳定RAF1表达。通过在OGT敲除的细胞中恢复RAF1的表达，再次证实了RAF1 有增加细胞EMT的作用。UUO大鼠肾组织也证实了RAF1以及O-糖基化产物的表达增加。综上，我们的结果证实，TGF-β1上调OGT的表达同时促进EMT，而葡糖胺促进O-糖基化的同时亦促进EMT的发生。在上述过程中，m6A甲基化以及RAF1参与其中，进一步通过针对m6A甲基化的调节以及对于RAF1的抑制可能为RIF的治疗寻找潜在的新靶点。