慢病毒介导的siRNA干扰PTPσ基因诱导脊髓损伤后轴突再生的研究

脊髓损伤的治疗至今仍是医学界的难题。在轴突再生过程中，跨越胶质瘢痕区域的延伸是修复的关键。硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）是存在于胶质瘢痕区域的主要抑制性因子。目前对于CSPGs作用机制的研究仍处于探索阶段。而2009年末所取得的突破性进展即为CSPGs受体PTPσ的发现。本研究项目立足于PTPσ，以RNA干扰（RNAi）技术为基础，结合第三代慢病毒载体，包装制备应用于大鼠脊髓损伤基因治疗的病毒转染系统。通过活体成像技术在体外培养和体内转染两个方面进行观察研究。并通过免疫组化、RT-PCR及Western-blot的方法观察治疗后PTPσ及CSPGs的表达变化；运用BDA顺行及逆行示踪技术观察皮质脊髓束和上行感觉传导束的损伤及修复，并结合体感诱发电位及行为学评价等指标从感觉和运动两方面评估脊髓功能的恢复。观察特异性小RNA（siRNA）阻断PTPσ基因表达后对于轴突再生的促进作用。

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的治疗至今仍是医学界的难题。在轴突再生过程中，跨越胶质瘢痕区域的延伸是修复的关键。硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）是存在于胶质瘢痕区域的主要抑制性因子。目前对CSPGs的研究仍然处于探索节段，常用的拮抗方法难以有效地阻断其对轴突再生的抑制作用，这主要是由于CSPGs类分子数量较多且各个分子的具体作用均不十分明确，而且其主要的抑制作用区域位于糖链上。而2009年末在该领域所取得的突破性进展即为CSPGs受体PTPσ的发现。与抑制CSPGs蛋白活性相比，抑制CSPGs受体PTPσ治疗脊髓损伤的方法更具有可行性。本研究项目立足于PTPσ基因，以RNA干扰（RNAi）技术为基础，结合第三代慢病毒载体，包装制备应用于大鼠脊髓损伤基因治疗的病毒转染系统，并通过体外实验及体内实验对其疗效进行系统的评估。体外培养大鼠神经元，应用慢病毒载体系统将高抑制活性siRNA导入神经元，qRT-PCR及Western blot检测si RNA的抑制效率，并利用免疫细胞化学技术观察PTPσ基因沉默对神经元轴突在CSPGs存在的条件下的再生及延长的影响。体内慢病毒局部注射，qRT-PCR及Western blot检测si RNA的抑制效率，免疫组织化学技术观察PTPσ基因沉默对神经元细胞、星形胶质细胞及突触形成的影响，BDA顺行示踪技术观察皮质脊髓束的损伤及修复，并结合体感诱发电位及行为学评价（BBB评分及脚印学分析）等指标从感觉和运动两方面评估脊髓功能的恢复。体外实验结果表明，siRNA可以体外有效的沉默PTPσ基因，PTPσ基因沉默的神经元在CSPGs基质上呈现出更长的轴突及更强的轴突穿越能力。体内实验结果表明，siRNA可以体内有效的沉默PTPσ基因，PTPσ基因沉默的神经元表现出更强的生存能力及更多的突触形成，而PTPσ基因沉默的星形胶质细胞并未呈现出更强的瘢痕形成能力。PTPσ基因敲除组，BDA顺行示踪发现更多的皮质脊髓束穿越脊髓损伤部位，体感诱发电位P1及N1的潜伏期明显缩短、波幅明显变大，行为学评价亦显示出更好的运动功能恢复。本研究为脊髓损伤的修复提供了新的思路，同时考虑到RNAi技术的临床应用前景及进展，亦为脊髓损伤临床修复策略的发展提供了方向。