研究受体膜蛋白信号转导功能的集成化蛋白质组学分析新方法

Membrane receptor is the “Gate” of any cells, which is the most important node for cellular signaling network. In all the FDA-approved drugs with known drug targets, membrane receptors occupy more than 40% in all the drug targets. The signal transduction function of membrane receptors is mostly regulated by protein phosphorylation and protein-protein interaction, and therefore, systems-level characterization of these two key molecular mechanisms has been a hot research area in the proteomics field. However, current research strategies have bottlenecks including low detection sensitivity and poor analysis selectivity which make these strategies hard to be applied for studying membrane receptor related signaling network in a physiological relevant condition. This project is aiming to develop a combinatorial proteomic approach with a focus on T cell expressed membrane receptors. By integrating all the sample preparation steps for phosphoproteomic analysis and applying the latest high-resolution MS technology, we expect to effectively reduce sample lose and significantly improve detection sensitivity. By introducing the SILAC-based quantitation technique and photo-reactive technique, we expect to significantly improve the analysis selectivity for characterizing membrane receptor interactome. More importantly, we emphasize the combinatorial application of both approaches for systematically characterizing membrane receptor related signaling network.

受体膜蛋白是进出细胞的“大门”，是细胞信号转导网络中最为重要的调控中枢。在美国FDA认证的已知靶点蛋白的药物中，受体膜蛋白约占所有药物靶点蛋白的四成之多。受体膜蛋白的信号转导功能一般都是由蛋白磷酸化修饰和蛋白间相互作用调控的，对这两种分子机制的系统水平研究一直是蛋白质组学研究的热点。然而，目前的研究策略存在着检测灵敏度低和分析选择性差的瓶颈，很难适应在接近细胞生理条件下的受体膜蛋白信号转导功能研究。本项目拟以T细胞受体膜蛋白为研究对象，发展一种集成化蛋白质组学分析策略；通过集成磷酸化蛋白质组学分析所有样品前处理步骤并结合使用最新的高分辨率质谱技术以期有效地降低样品损失并显著地提高方法检测灵敏度；通过结合使用SILAC定量分析技术和光敏反应技术以期有效提高受体膜蛋白相互作用组分析的选择性。更为重要的是，本项目强调两种组学策略的集成化分析和应用，以期实现对受体膜蛋白相关信号转导通路的全面解析。

受体膜蛋白是进出细胞的“大门”，是细胞信号转导网络中最为重要的调控中枢。在美国FDA认证的已知靶点蛋白的药物中，受体膜蛋白约占所有药物靶点蛋白的四成之多。受体膜蛋白的信号转导功能一般都是由蛋白磷酸化修饰和蛋白间相互作用调控的。本项目针对目前的蛋白磷酸化修饰和蛋白间相互作用研究策略检测灵敏度低、选择性差的瓶颈，系统地进行了方法学开发和应用研究。发展了高灵敏度集成化蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学样品前处理技术SISPROT、3D-SISPROT、Phospho-SISPROT，实现少量细胞的大规模磷酸化蛋白质组学分析。发展了含有光敏反应基团和磷酸化修饰的CD28膜内区完整序列探针，实现对 T 细胞受体膜蛋白相互作用组及其作用位点的系统表征，为 T 细胞相关信号转导通路的全面解析提供系统水平分析工具。在受体膜蛋白双向功能复合物的分离和分析新方法方面，利用含有多功能基团的小分子探针技术并结合SH2结构域，开发了Photo-pTyr-scaffold技术。实现了受体膜蛋白的膜内区域相关功能蛋白质复合物的高选择性标记、富集和蛋白质组学分析。将上述技术中的Photo-pTyr-scaffold结合到streptavidin包被的96孔板上，形成光亲和性正向蛋白阵列平台。该平台不仅可以高通量的检测酪氨酸磷酸化调控的蛋白质复合物及其相互作用的动态分析，并且可以用于探究靶向酪氨酸磷酸化蛋白质复合物药物的作用机理，为靶向药物作用机理的研究提供更便捷的筛选平台。发展整合蛋白质组学分析策略，揭示了LIF在胰腺肿瘤发生中的重要生物学功能，并且表明其成为有效的治疗靶标以及肿瘤诊断标志物的光明前景。所开发的整合蛋白质组学分析策略为探寻胰腺癌治疗和诊断的分子靶标提供了重要可靠的线索，为更好地理解肿瘤微环境中的细胞间信号传导网络提供了新颖的系统水平研究工具。