基于离子液体的膜蛋白质组样品预处理新方法研究

The high hydrophobic nature of membrane proteins is a key factor in limitation of the development of membrane protein analysis, thus, the development of ideal solubilizing system becomes the major trend in present membrane proteomics analysis. The project aims to solve the problem of present solubilizing system in poor dissolving capability for membrane proteins and incompatible with subsequent digestion, separation and mass spectrometry identification. Intend to perform the following research work: 1) Filter the optimized solubilizing system to improve the solubilization of membrane proteins by altering the anion and cation structure of ionic liquids and evaluating the performance of each kind of ionic liquids on their optimized conditions; 2) Reveal the mechanisms of the ionic liquids for membrane proteins solubilization by molecular dynamics simulation and force field construction of ionic liquids, further to offer the theoretical guide for the synthesis and application of novel ionic liquids; 3) Develop ionic liquids based membrane proteins relative quantification method to improve the accuracy and precision of quantification. Based on the above work, the novel method will be applied for high and low transfer cell line of hepatocellular carcinoma differential membrane proteomics analysis, to find more potential target proteins associated with tumor metastasis and drug targets, thereby, offering the theoretical basis for early diagnosis and treatment of liver cancer patients.

膜蛋白质疏水性强是制约膜蛋白质组分析发展的重要因素，因此发展理想的溶解体系成为目前膜蛋白质组学研究的重要方向。本项目针对现有溶解体系对膜蛋白质溶解性能力低，并且与蛋白质酶解、分离和质谱不兼容等问题，拟开展以下研究工作：1）改变不同离子液体阴阳离子组成，通过系统实验分析，筛选最适于膜蛋白质分析的离子液体溶解体系，并建立相应的膜蛋白质组预处理方法，提高膜蛋白质组的分析效率；2）采用分子动力学模拟，建立离子液体力场模型，对实验结果进行理论解释，揭示离子液体和膜蛋白质的作用机理，以期为设计合成新的离子液体提供理论指导；3）发展基于离子液体增溶的膜蛋白质组相对定量方法，提高定量的准确度和覆盖率；将上述新方法用于肝癌高、低转移细胞株的差异膜蛋白质组分析，以期发现更多潜在与肿瘤转移相关膜蛋白质及药物靶点，为肝癌患者的早期诊断和治疗奠定基础。

本项目针对针对膜蛋白质组学研究中现有的样品预处理体系存在的溶解能力低，与酶解、分离和质谱不兼容等问题，从实验和理论研究两个方面对离子液体与膜蛋白质的相互作用机理进行了研究，探讨了离子液体对膜蛋白质的增溶机理及其对胰蛋白酶酶活的兼容性，结果表明，离子液体与膜蛋白质间的相互作用力主要为疏水相互作用，并且由于其不会影响胰蛋白酶催化三联体的三维结构，从而从理论上揭示了离子液体不会影响酶的活性的原因，同时筛选出C12Im-Cl作为最佳的离子液体体系进行膜蛋白质分析，建立了基于离子液体的膜蛋白质样品预处理方法，将该方法用于与SDS方法相比，采用该方法鉴定到鼠脑提取蛋白的IMPs和跨膜肽段分别提高了40%和250%；在此基础上，发展了基于离子液体的膜上样品原位预处理策略（i-FASP），与文献报道的SDS方法相比，能够将HeLa细胞的鉴定蛋白质的数目提高15.8%（4,034 vs 3,482）；为了有效降低高丰度的水溶性蛋白质对低丰度膜蛋白质的抑制，发展了基于离子液体顺序提取的蛋白质处理方法，应用于HeLa细胞系的膜蛋白质组分析，共鉴定到5,553个膜蛋白质（对应4,419个基因），其中有2,573个为整合膜蛋白质（对应2,183个基因），是目前最为全面的关于HeLa细胞系膜蛋白质组数据集；为了提高蛋白质组深度分析覆盖度，发展了基于离子液体的蛋白质组深度覆盖分析方法，从HeLa细胞系中鉴定到11,313个蛋白质，包括3,785个膜蛋白质和1,916个跨膜蛋白质；最后将SILAC代谢标记技术、离子液体样品预处理技术、液相分级和气相分级技术、质谱无动态排除扫描技术相结合，发展了一种基于二级质谱碎片全离子监测的蛋白质组相对定量分析方法，应用于人肝癌高低转细胞株的蛋白质组相对定量分析，定量到7656个蛋白质，其中161个蛋白质的表达发生了显著性变化，其中有66个蛋白质已有文献报道与肝癌和肿瘤转移相关，95个蛋白质未见报道。选择其中6个未经报道的差异蛋白质进行了West-Blotting验证，生物验证结果与定量结果一致。相关研究成果发表SCI论文6篇，申请发明专利4件，培养博士研究生4名。