基于CRISPR/Cas9系统检测非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因的研究

Current studies have shown that EML4-ALK fusion gene should be tested in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) before treating with individualized targeted drug-crizotinib. At present, fluorescence in situ hybridization (FISH) is the standard method for clinical trial validation, but it has a high operation requirement, a long detection cycle, and it is expensive, which limited the widespread use. In our preliminary study, we demonstrated labeling of repetitive DNA elements by CRISPR/Cas9-based technology, and the process is remarkably rapid, convenient, and treat the sample mildly without heat-denaturing of dsDNA. Therefore, based on previous research, we firstly optimize the fluorescently labeled nuclease-deficient Cas9(dCas9) protein and sgRNA structure to overcome the difficulties in non-repetitive sequence imaging in vitro. Then by using this dCas9/sgRNA probes to test the EML4-ALK fusion gene in NSCLC tissue samples, we expect to establish a rapid, simple and economical new method of EML4-ALK fusion gene detection. Furthermore, the performance of the new method, such as accuracy, repeatability, and sensitivity, will be evaluated, then compared with FISH, verifying the application potential of this method in clinical molecular diagnostic. We believe this research will help to provide new tools and ideas for the rapid detection of EML4-ALK fusion gene, and provide references for other related gene detection studies.

晚期非小细胞肺癌患者使用个体化靶向药物克唑替尼治疗前必须检测是否存在EML4-ALK融合基因。目前荧光原位杂交（FISH）是临床EML4-ALK融合基因检测的标准，但存在操作要求高、检测周期长、费用高等缺点。在前期研究中，我们采用CRISPR/Cas9技术进行体外重复DNA序列荧光标记，具有操作简便快速、无需高温变性处理等优点。因此，本项目拟在前期研究基础上，进一步优化dCas9蛋白-荧光配体及sgRNA结构，解决CRISPR技术非重复序列标记的难题，并将该技术用于非小细胞肺癌组织样本EML4-ALK融合基因检测研究，建立一种快速、简便、经济的EML4-ALK融合基因检测新方法，并对该方法进行准确性、重复性、灵敏度等性能评价，与FISH方法进行比较，探讨该方法在临床分子诊断中的应用价值。本研究将有助于为EML4-ALK融合基因快速检测提供新的工具和思路，并为其它相关基因检测的研究提供借鉴。

晚期非小细胞肺癌患者使用个体化靶向药物克唑替尼治疗前须检测是否存在EML4-ALK融合基因。目前荧光原位杂交（FISH）是临床EML4-ALK融合基因检测的标准，但其检测对于操作和判读技术要求较高，且成本昂贵，因此EML4-ALK融合基因的检测方法仍有待改进。基于CRISPR/dCas9技术进行体外重复DNA序列原位荧光标记，具有操作简便快速、无需高温变性处理等优点，然而其对于非重复核酸序列的标记效果不佳。本研究中，我们通过原核表达纯化dCas9-Halo标签融合蛋白，可采用多种Halo荧光配基实现对dCas9蛋白不同颜色荧光标记用于核酸检测，此外，为进一步增加dCas9与sgRNA的结合亲和力，提高信噪比，我们对sgRNA结构进行了优化，将sgRNA序列中将AU翻转中的U碱基突变为G。我们首先以端粒重复序列的检测对sgRNA/dCas9检测体系进行验证及优化染色条件，结果显示端粒-sgRNA/dCas9荧光复合物可成功检测体外固定细胞中染色体端粒，探针浓度为0.5nM、染色时间30分钟时荧光标记效果最好。接下来我们针对含重复序列的MUC4基因2号外显子及相邻3号内含子为靶点设计sgRNA，分别与两种不同荧光标记的dCas9蛋白分别组装后对其进行检测，进一步验证了该方法进行双基因标记的能力。通过设计多条sgRNA，利用该检测体系我们对非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因进行了检测。结果显示，对于EML4-ALK阳性的细胞系，可在部分细胞中观察到分离荧光信号的阳性结果，但背景干扰较多，后续需进一步优化检测条件，减少背景干扰。本研究中我们初步建立了针对非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因检测的新方法，该方法操作简便，省时，对EML4-ALK融合基因具有一定的检测能力，但仍需对方法学进行优化后进一步验证。本研究为非重复基因序列的分子检测提出有效解决思路，扩宽了基于CRISPR/Cas9系统的成像方法的适用性，对其他非重复序列的体外标记也具有一定借鉴意义。