脂筏及其相关蛋白在线虫精子细胞活化中的作用

脂筏在哺乳动物细胞的凋亡、细胞粘附和迁移、细胞骨架的组装等生物学过程中都发挥了重要作用。以精子主要蛋白为运动蛋白的线虫精子具有基因组明确、结构简单等优点，而目前关于脂筏在线虫精子细胞活化及运动中的作用国内外尚未有报道。本课题组的前期工作已证实在线虫精子活化前后脂筏的定位发生改变，脂筏的重要组分胆固醇参与了精子活化，定位于脂筏的酪氨酸激酶 Src在线虫精子中有表达并且在活化的精子伪足中有分布。在此基础之上，本课 题将以线虫精子的脂筏及相关蛋白为研究目标，通过β-CD和PDMP等抑制剂的使用、western blot、免疫荧光、免疫共沉淀、反向遗传学等实验手段，进一步研究脂筏主要组分对线虫精子活化的重要性、相关蛋白在精子中的表达和定位及其缺失对线虫精子活化和运动的影响，探讨在线虫精子活化及运动过程中脂筏相关的信号转导途径，从而为明确脂筏及其相关蛋白在线虫精子活化中的作用奠定基础。

在哺乳动物细胞中, 脂类微结构域 (LM) 介导了多种细胞活动,如粘附,迁移,增殖等. 目前已有报道在线虫的一些细胞如神经细胞中有LM的存在, 但其是否在精子中存在并起何作用尚未有研究报道。在哺乳动物精子成熟获能过程中，精子细胞质膜上的胆固醇浓度降低，这一过程具有重要的生物学功能。与哺乳动物精子不同，秀丽线虫的精子细胞具有完全不同的运动形态，以伪足的爬行取代鞭毛运动。那么胆固醇以及LM在线虫精子细胞激活过程中有何作用呢?.用LM的标志分子CAV-1作免疫荧光及免疫电镜的实验发现在未活化的精子中CAV-1主要定位于线虫精子特有的细胞器MO中,在膜上也有一定的分布。精子活化后,CAV-1在胞体上的定位没有太大改变,但在伪足上也有分布。LM是富含胆固醇及糖鞘脂的区域,用菲律宾毒素指示胆固醇在线虫精子上的定位发现，胆固醇在膜上有广泛分布，且有部分较强的点状或团状分布的信号，精子活化后，胆固醇主要集中在胞体上。用MCD提取体外解剖的线虫精子膜上的胆固醇后,再用monensin活化细胞，发现该处理使线虫精子MO不能融合，细胞不能正常活化，但如果MCD预先与胆固醇孵育，这种抑制作用消失。在培养线虫时去掉培养基的胆固醇发现F3的线虫后代非常少，从雄性线虫中解剖出的精子大部分不能被monensin活化. 虽然雄虫交配行为没有明显改变，但转移到对方储精囊中的精子明显少于对照，且有部分分布于vulva与储精囊之间的体腔中，证明缺失胆固醇导致雄虫内的精子减少且运动能力降低。同时，缺失胆固醇的雌雄同体线虫的储精囊中精子也明显少于对照，将储精囊的精子解剖到SM溶液中，缺失胆固醇的精子仅有少部分是正常活化的。体外和体内的实验结果都说明胆固醇对线虫精子的活化是必须的。.通过用D-PDMP抑制糖鞘脂的合成我们发现糖鞘脂对线虫精子的活化也是至关重要的。随着浓度的升高，D-PDMP逐渐抑制了monensin诱导的线虫精子MO融合以及活化，在这过程中，如果同时添加糖鞘脂，则能恢复正常的活化。正常爬行的线虫精子用D-PDMP冲浴后运动逐渐停止，若用D-PDMP及糖鞘脂的混合溶液继续冲浴，则精子爬行能被完全恢复。在体内针对糖鞘脂合成酶进行RNAi实验，发现线虫后代减少，主要原因为精子产生减少。.本课题的主要研究成果已经在BBA-molecular and cell biology of lipids上发表。