基于银杏细胞培养体系的白果内酯和银杏内酯生物合成下游途径及其代谢调控机理研究

Semen Ginkgo and Folium Ginkgo, documented in Chinese Pharmacopeia, are derived from Ginkgo biloba L. and possess multiple pharmacological activities. Ginkgo Terpene Lactones (GTLs) are the main biologically active components of Ginkgo biloba. Commercially, GTLs are extracted and prepared from the leaves of the G. biloba tree. But, the content of GTLs is very low in the G. biloba tree. Moreover, the chemical synthesis of GTLs is not applicable for the large-scale production of GLTs due to the complicated chemical reactions. Therefore, it is crucial to elucidate the biosynthetic pathway of GLTs for solving this problem by modern biotechnology. For the biosynthetic pathway of GLTs, the upstream and midstream steps have been elucidated so far; however, the downstream steps from Levopimaradiene to GTLs are still unclear. Because production of GLTs is tissue-specific, the investigation on the biosynthetic pathway of GLTs is limited in the culture system of dedifferentiation cells. To solve this problem, the stem cell culture system of G. biloba, which retains all the genetic information of parental plant cells, was established in our previous study. The current project aims to isolate and identify intermediate products and key enzymes in the biosynthetic pathway of GTLs using the culture system of G. biloba stem cells. On this basis, the mechanism of its metabolic regulation will be explored by analyzing the influence of endogenous and exogenous factors as well as the overexpression and/or silence of related enzyme genes. This project will investigate the downstream biosynthetic pathway of GTLs and the mechanism of its metabolic regulation in the plant stem cell culture system for the first time in the world. The research findings will provide an understanding of plant stem cells in application of the investigation of biosynthetic pathways, as well as the scientific basis for mass-production of GTLs by biotechnology.

中药白果及银杏叶具有多种药理作用，其主要活性成分为银杏萜内酯（GTLs）。GTLs主要源于植物提取，但产率很低，而化学合成步骤繁杂，难以产业化。故，人们一直寻求利用生物技术方法生产GTLs，而阐明其生物合成途径则是关键所在。GTLs生物合成上游和中游途径已被阐明，但其下游途径中由左旋海松二烯如何生物合成GTLs至今仍不清楚。由于GTLs产生具有高度组织特异性，故脱分化细胞不适用于GTLs生物合成研究。为了阐明GTLs生物合成下游途径，我们拟在已建立拥有母体全套遗传信息的银杏干细胞体系基础上，分离鉴定GTLs生物合成途径中的中间体及其关键酶；利用内外源因子干预、基因过表达与沉默等手段，对GTLs生物合成进行代谢调控研究。此项目系国内外首次利用银杏干细胞体系法研究GTLs生物合成下游途径及代谢调控机理，研究成果可为植物干细胞新用途和利用生物技术方法解决GTLs原料来源提供理论基础和科学依据。

建立了测序深度为10G的银杏转录组，从中鉴定出9个可能的TPS，其中GbTPS1和GbTPS2互为variants；表征了其余7个TPS的功能。除GbTPS1和GbTPS2外，本研究还首次克隆并表征了银杏中的单萜合成酶（龙脑和2-蒎烷醇）（GbTPS3）、13-表泪杉醇合成酶（GbTPS5）、二氢法尼醇合成酶（GbTPS7）、反式橙花叔醇合成酶（GbTPS8）和左旋海松二烯合成酶（GbTPS9）。植物中出现的序列相似度非常高的TPS variants，目前尚未见深入研究之报道。本论文研究发现：GbTPS1系没药烯合成酶，定位于叶绿体，且主要分布于银杏幼龄期的根中；GbTPS2催化产物不仅含有没药烯（1），亦有没药醇（2）和化合物3，定位于细胞质，主要分布于银杏一年生长期的叶片中。研究结果首次发现：GbTPS2具有独特的催化功能，可通过相互独立的催化过程，分别发挥环化作用和氧化作用。此外，本论文对GbTPS1和GbTPS2应对外界刺激以及没药烯合成酶在进化方面的差异进行了研究和分析。结果表明：GbTPS1和GbTPS2对机械损伤以及水杨酸和茉莉酸甲酯诱导响应不同。推测GbTPS1和GbTPS2可能是各自位于独立的信号通路，受到差异激活方式控制，抑或是多层次并且具有针对性的存在于防御机制中。银杏中没药烯合酶在长期的进化演变过程中，仍然通过统一的整体在自身体内进行功能的分化，且具有高度的保守性。此外，GbTPS1与冷杉（Abies grandis）中没药烯合成酶的蛋白序列相似度高达70%，基于晶体结构已知的没药烯合成酶，通过同源建模和分子对接研究GbTPS1和GbTPS2的结构区别。结果表明：在结构上GbTPS1同时具有αβγ三个结构域，而GbTPS2缺失了大部分γ结构域。GbTPS1和GbTPS2与底物分子FPP结合时，活性口袋有明显的差异，同时FPP立体构型也发生了变化，从而导致GbTPS1和GbTPS2具有不同的催化功能。