当归多糖促软骨基质氨基葡聚糖合成的分子机制研究

骨关节炎(OA)在我国患病率约10%，老年人群已高达50%，严重影响了老年人生活质量。软骨基质中蛋白多糖缺失是OA最主要的病理特征。本课题组前期利用细胞和整体实验，证实当归防治OA有效的基础上，筛选出有效部位-当归多糖，证实其能促进软骨基质成分氨基葡聚糖(GAG)的合成和提高GAG合成关键酶-葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ(GlcAT-I)的表达。文献提示，多糖结构中半乳糖的硫酸化可增强GlcAT-I活性。为此，本课题拟采用凝胶柱层析法结合细胞水平GAG/GlcAT-I表达检测，筛选当归多糖的有效活性组分；利用动物OA模型全面证实当归多糖的促GAG/GlcAT-I表达和抗OA疗效；进一步通过确证当归多糖及其半乳糖在体内发生的硫酸化反应和本课题组已建立的蛋白组学技术，寻找当归多糖提高GAG/GlcAT-1表达的作用环节及其分子机制，为研制基于新机制、新靶点并具有自主知识产权的抗OA新药，提供研究依据。

本课题采用凝胶柱层析法对当归粗多糖进行组分分离，在细胞水平筛选和确认当归多糖促进GAG表达的最有效组分，利用动物OA模型全面证实当归多糖活性组分的促GAG表达和抗OA疗效，在细胞水平证实当归多糖活性组分对OA软骨细胞基质合成的影响及细胞活力观察，应用基因芯片和蛋白组学技术筛选当归多糖活性组分防治OA的有效靶标，并用分子生物学技术进一步验证。结果（1）ASP-1为当归多糖促进软骨细胞GAG合成的最有效组分。（2）ASP-1经灌胃给药或关节腔注射给药可促进大鼠OA退变软骨修复，增加基质含量，对抗骨性关节炎进程，上调大鼠OA软骨基质UDP-糖合成酶和转移酶的表达。（3）ASP-1可促进大鼠OA软骨细胞基质aggrecan合成，主要体现在增加GAG含量、促PGs合成、上调aggrecan基因的表达，但不影响细胞的增殖、凋亡以及Ⅱ型胶原基因的表达。（4）蛋白组学和基因表达谱分析显示ASP-1主要是通过上调基质合成相关酶的基因表达来促进软骨细胞基质合成，而对基质降解相关酶的基因表达没有影响，RT-PCR和Western Blot证实了ASP-1主要是通过上调UDP-糖合成酶（UXS1、GALE、GALT和UGDH）的表达来增加UDP-糖合成，上调UDP-糖转移酶（XylT-1、GalT-1、GalT-2、GlcAT-1和CsgalnacT-1）的表达来促进基质GAG合成，这些提示了当归多糖活性组分防治OA是一个多步骤、多靶点的效应。本研究首次将活性最好的当归多糖为系列抗OA中药多糖的代表，确定当归多糖的抗OA治疗作用及其最有效活性成分，阐明当归多糖治疗OA的作用环节及其分子机制，为研制基于新机制、新靶点并具有自主知识产权的抗OA新药，提供了研究依据。