当归多糖特异性肝靶向的分子机理研究

当归是我国传统医学"补血活血"要药。根据"肝调气，气机畅达则脾胃化生血液正常"的中医理论推测，当归治疗贫血的药理机制中，除了作用于造血系统的生血作用，也有作用于肝脏的补肝益气功效。本课题组在研究当归多糖及当归多糖铁复合物的最新药理活性中发现，当归多糖对肝脏有很强的亲和力，具有潜在的肝靶向活性。若进一步研究当归多糖特异性肝靶向的具体分子机制，将为证实当归通过肝脏而发挥各种药理活性的中医理论提供实验依据，为植物多糖肝靶向作用提供新的理论支持和研究基础。本课题拟提取地道药材"岷县当归"中的当归多糖，按照不同分子量段进行分离纯化，同时采用现代分子生物学技术及波谱检测技术，研究不同分子量段当归多糖与肝细胞表面不同受体的结合活性同它们各自结构特征的相关性，阐明当归多糖通过受体特异性结合达到主动肝靶向的分子作用机理。为把同时具有肝靶向以及肝病防治作用的生物活性大分子开发成肝靶向给药系统载体提供研究基础。

本课题组在前期实验中发现当归多糖抑制铁负性调节因子hepcidin在肝脏中的表达，推测当归多糖对肝脏有很强的亲和力。本课题以岷县当归饮片为原料，按照不同分子量段进行分离纯化，进一步研究当归多糖特异性肝靶向的分子机制。.将当归多糖ASP1经异硫氰酸荧光素（FITC）标记，得到荧光强度较高、稳定性良好且适用于后续体内外特异性肝靶向研究的荧光物质（FA）。建立生物样品中ASP1含量测定方法，ASP1在各生物样品中的定量下限为0.20 μg/mL，在0.25~20.00 μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，r2﹥0.9990。测定0.5 μg/mL、2.5 μg/mL和25.0 μg/mL三种不同浓度样品的回收率和精密度，测得回收率在91.98%~114.20%之间，精密度相对标准偏差符合要求。 .参考ASP1在大鼠体内的药代动力学和组织分布，测定ASP1的药时曲线和药代动力学参数，确定ASP1尾静脉给药后在大鼠体内的组织分布取样时间点为30 min、60 min和120 min。给药120 min后，血液中ASP1浓度降至Cmax的1/60以下，此时ASP1在血液和各组织中浓度由高到低依次为肝≫血液＞肠＞心＞脾＞肺＞胃＞肾＞脑，肝脏中ASP1的浓度高出其它组织中浓度的30倍以上，充分说明ASP1具有很强的特异性肝靶向作用。.已有的文献报道，葡聚糖（dextran）是甘露糖受体的一种配体，对其进行FITC荧光标记，标记产物命名为FD。采用两步灌流法提取分离大鼠肝实质细胞和非实质细胞，比较FA与FD各自在不同肝细胞中的分布，肝实质细胞对FA的摄入量占肝总细胞对FA摄入的93.2%，而肝实质细胞对FD的摄入量占肝总细胞对FD摄入的43.1%。实验结果可知FA主要被肝实质细胞摄入，肝脏组织切片的荧光显微镜观测也证实这一结论。.在当归多糖ASP1体外靶向实验中，靶向率随着ASP1浓度递增而加大，50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL剂量组的靶向率分别为73.93%、94.83%和98.23%，证实了ASP1对肝细胞有很强的主动靶向作用。.当归多糖富含半乳糖残基，以pululan为竞争拮抗剂进行半乳糖受体拮抗实验，实验表明ASP1可被pululan竞争性拮抗，证实ASP1是通过半乳糖受体介导作用被肝实质细胞摄入。