高致病性H5N8禽流感病毒PB2-I283M-K526R突变致小鼠致病性增强的作用机制

Outbreaks of HPAI H5N8 virus have caused significant economic losses to the poultry industry, and more importantly, its potential threat to public health cannot be neglected. Our previous study demonstrated that the synergistic effect of 283M and 526R in PB2 may enhance replication of an avian influenza virus in mice through enhanced polymerase activity. Therefore, it is crucial to explore the molecular basis and host mechanism for the high virulence of H5N8 AIV in mammals. The following experiments will be performed.(1) we will analyze the differences of the expression of gene expression in mice lung by RNA sequencing. (2) we will construct and identify the recombinant AIVs with His tag insertion in its PB2-coding region based up a pair of AIVs that differ greatly in their virulence in mice. (3)We will identify cellular proteins interacting with PB2 by affinity chromatography and LC-MS/MS and bioinformatics. (4)We will confirm the interaction of the cellular protein and PB2 protein by GST-pull down, co-immunoprecipitation and confocal microscopy assays. (5) We will explore the specific functions of selected host factors or proteins in influenza virus replication cycle by over-expression, siRNA and CRISPR/Cas9 system, and how they affect influenza virus replication and its polymerase activity.

高致病性H5N8禽流感（AI）的爆发给养禽业带来巨大经济损失，对人类健康也存在威胁。前期研究表明PB2-I283M-K526R联合突变增强了其对小鼠的致病性，而PB2基因这种适应性突变的致病机理尚不清楚。本研究旨在通过挖掘病毒感染过程中与PB2蛋白相互作用的宿主蛋白，为新型药物的设计提供靶标。研究内容主要包括：（1）通过RNA sequencing分析比较模式病毒在小鼠肺脏中基因的表达差异；（2）稳定表达外源标签模式病毒的拯救与鉴定；（3）通过亲和层析结合液相色谱-串联质谱筛选与模式病毒PB2相关的差异蛋白；（4）使用GST-pull down, co-IP和激光共聚焦方法对PB2与宿主细胞蛋白相互作用验证；（5）通过过表达、小RNA干扰和CRISPR/Cas9系统探索选择的宿主因子或蛋白在流感病毒复制周期中的具体功能，是如何对流感病毒复制及其病毒聚合酶活性产生影响的。

高致病性H5N8禽流感病毒（AIV）持续威胁着家禽和人类健康。前期研究表明PB2-I283M-K526R联合突变增强了其对小鼠的致病性，而PB2基因这种适应性突变的致病机理尚不清楚。完成的研究内容主要包括：（1）进一步通过对数据库中的流感病毒PB2基因序列分析，在PB2-283位点确定了新的突变模式M/L/I/L/T/V，发现了PB2-M283L突变增强了病毒在哺乳动物细胞中的复制能力和聚合酶活性，增加了小鼠脏器中的病毒载量，增强了对小鼠组织的病理学损伤和导致更强的炎症因子风暴。PB2-M283I突变则与之呈现完全相反的表型。揭示了PB2-283位点替换在H5亚型流感病毒适应哺乳动物宿主中的重要作用。（2）通过免疫沉淀技术结合液相色谱-串联质谱技术对PB2的宿主互作蛋白进行了筛选，通过进一步的生物信息学分析，揭示了PB2-I283M-K526R蛋白在调控病毒生命周期及致病能力方面的作用。分析了可能导致1283M及K526R联合突变影响哺乳动物致病性的关键宿主互作蛋白。（3）通过体内外模型，探究A型流感病毒（IAV）PB2蛋白抑制干扰素反应和高致病性禽流感病毒跨物种传播的潜在机制。研究发现，IAV PB2蛋白降低了宿主细胞对干扰素的敏感性，抑制了STAT1/STAT2和抗病毒蛋白的激活。此外，IAV PB2蛋白靶向哺乳动物JAK1的赖氨酸859和860位点并进行泛素化降解。更为重要的是，H5亚型高致病性禽流感病毒PB2-I283M/K526R突变增加了对哺乳动物JAK1的降解能力，在哺乳动物细胞和小鼠肺组织中表现出更高的复制效率，并在感染小鼠中造成更高的死亡率。揭示了PB2蛋白调控IAV逃逸干扰素抗病毒作用的新机制，证实了高致病性禽流感病毒可以通过适应性突变增强对哺乳动物的致病性，对防控禽流感病毒跨宿主感染及保障人类健康具有重要意义，为新型药物的设计提供靶标。