H5N1亚型禽流感病毒NA基因茎部氨基酸部分缺失拮抗干扰素的机制研究

H5 subtype avian influenza virus (AIV) is an important zoonotic pathogen, which becomes the dominant strain with partial deletion in neuraminidase(NA) gene under the natural selection. However the mechanism of evolution for the virus has not yet been studied and reported. Viral replication capacity in recombinant human IFN-β pretreated Vero cells revealed that both the mutant of H5N1 subtype AIV with amino acids deletion in the NA gene and/or NS gene were required for the interferon resistance of H5N1 subtype AIVs, and the reassortment of H5N1 subtype AIV with amino acids deletion in the NA gene play more important role in the interferon resistance in our previous study, and the mechanism of evolution for the virus has not yet been studied and reported. In this project, we will perform the following experiments:(1)A group of reassortment H5N1 subtype AIVs with partial deletion in NA gene were generated by reverse genetics technology. (2)The biological characteristics of the reassortment virus es were determined. (3)The neuraminidase activity of the reassortment viruses were detected.(4) The anti-interferon ability of the reassortment viruses were detected and compared. (5) Eukaryotic expression plasmids with amino acids deletion in the NA gene were constructed and transfected, the neuraminidase activity and the anti-interferon ability of NA proteins were detected. The results may help us to understand the role of partial deletion in NA gene in the process of viral evolution.

H5亚型禽流感病毒（AIV）是重要的人兽共患病病原，在自然选择条件下NA基因部分缺失的H5N1亚型AIV演变为优势流行株，但其成为优势流行株的理论依据未见报道。我们前期研究发现NA茎部缺失的禽流感病毒增强了其拮抗干扰素的能力，且比NS1基因缺失拮抗干扰素的作用更强，相关机制更是不清楚。本研究的主要内容包括（1）利用反向遗传技术构建出NA基因茎部不同模式缺失的H5N1亚型重组AIV；（2）测定重组病毒的生物学特性；（3）检测NA基因部分缺失对神经氨酸酶活性的影响；（4）检测NA基因部分缺失对抗干扰素作用的影响；（5）构建真核表达不同长度NA茎部的NA蛋白，检测NA基因部分缺失对神经氨酸酶活性和抗干扰素作用的影响。研究结果可有助于阐明NA基因部分缺失在生物进化过程中的作用。

自1996年第1株H5N1亚型高致病性AIV被分离以来，H5N1亚型AIV的NA基因出现了不同形式的缺失，且茎部第49-68位缺失20个氨基酸的毒株成为优势流行株。前期研究发现，NA茎部缺失有助于H5亚型AIV拮抗干扰素，但机制不清楚。本研究以NA茎部缺失的H5亚型AIV为母本，构建一系列只有NA茎部突变的重组病毒，测定其生物学特性及拮抗干扰素能力的差异， 结果显示，突变病毒的TCID50 、EID50和MDT值无显著性差异。NA茎部加长可增强病毒在MDCK和CEF上的复制能力，而NA茎部缺失会少量提高病毒在Vero上的复制能力。神经氨酸酶试验表明NA茎部越长NA活性越高。空斑试验显示随着NA茎部的加长空斑直径增大。病毒感染细胞IFN-α和IFN-β的转录表达水平检测结果显示，在12 h内，IFN-α和IFN-β mRNA的表达量随着 NA茎部的缩短而升高，在24 h随着NA茎部的缩短而降低。表达不同NA茎部长度的真核质粒转染Vero细胞后，加入不同浓度的IFN-β作用，再用突变病毒感染IFN-β预处理过的Vero细胞，测定TCID50。结果表明，NA真核表达质粒对突变病毒拮抗干扰素的能力都有所提高，且NA茎部短的作用更明显。突变病毒感染不同浓度IFN-β预处理过的Vero细胞，收集细胞上清，测定TCID50，结果显示只有rSNA-15和 rSNA-20在IFN-β浓度达到10000U时，仍可以复制。病毒感染CEF细胞，利用Western-blot测定不同时间点NA和NS1蛋白表达水平。结果显示，在不同时间点，随着NA茎部的缺失，NA蛋白的表达量逐渐减少而NS1蛋白的表达量逐渐增多。病毒感染以IFN-β预处理的Vero细胞后，检测NA和NS1基因mRNA的转录水平。结果显示，NA茎部缺失20个氨基酸的毒株，在不同时间点NS1 mRNA 的表达量均比其他各缺失株高，且随着NA茎部的缩短NS1 mRNA的表达量呈现逐渐增加的趋势，但NA的mRNA的表达量无显著性差异。.综上，H5N1亚型AIV NA茎部缺失株拮抗干扰素的作用位点在茎部缺失15或20个氨基酸，可能是通过增强NS1的表达来拮抗干扰素的。分析了NA茎部缺失在H5N1亚型AIV拮抗干扰素过程中的作用，该研究对解析H5N1亚型AIV的进化机制具有重要的学术意义。