烟草曲茎病毒编码的AC3蛋白增强病毒致病性的作用机制

Tobacco curly shoot virus (TbCSV) is a typical begomovirus that not stringent in requirement for a betasatellite. TbCSV can infect host plants and induce disease symptoms in the presence or absence of its betasatellite (TbCSB), and TbCSB is not necessary for infection but intensifies symptoms in a host-dependent manner. Although previous studies have revealed suppressors of RNA silencing encoded by TbCSV and TbCSB are symptom determinants, whether and how the othor proteins encoded by TbCSV involved in symptom induction is still unknown. In our previous studies, PVX-based overexpression of TbCSV AC3 intensified disease symptoms on Nicotiana tabacum. Based on these results, we are going to construct the infectious clone of TbCSV AC3 mutant and use PVX mediated gene expression so as to elucidate the effect of AC3 protein on the pathogenicity of virus and its functional domain. By using transgenic technology, protein interaction and high-throughput sequencing and bioinformatics software combined with the TRV-mediated gene silencing, we are going to investigate the key pathways / factors that AC3 protein involved in and reveal the roles of AC3 protein acting in the host, and finally illustrate the mechanism how AC3 protein intensifies TbCSV/TbCSB pathogenicity. The implementation of the project is expected to provide a more scientific basis for further elucidating the pathogenic mechanism of the begomovirus/betasatellite disease complex, as well as providing new ideas for plant antiviral breeding.

烟草曲茎病毒(TbCSV)单独侵染可诱导寄主产生严重症状，但伴随β卫星(TbCSB)时症状加重，是不完全依赖β卫星的双生病毒致病类型的典型代表；除明确RNA沉默抑制子是症状决定因子外，其余蛋白是否参与症状形成及其作用机理仍不清楚。我们在前期研究中发现利用PVX载体表达TbCSV AC3蛋白可在本氏烟上加重PVX的症状，本项目拟在此基础上通过构建TbCSV AC3突变体侵染性克隆并借助PVX载体介导基因表达技术明确AC3蛋白对病毒致病性的影响及其功能域；利用转基因、蛋白互作、高通量测序和生物信息学软件并结合TRV介导基因沉默技术明确AC3蛋白增强病毒致病性途径中的关键寄主因子，进而揭示AC3蛋白与寄主互作的途径和方式，最终解析AC3蛋白增强TbCSV/TbCSB致病性的作用机制。项目的实施可望为进一步阐明双生病毒/β卫星病害复合体致病机理提供更详尽的科学依据，也可为植物抗病毒育种提供新思路。

双生病毒编码的C3/AC3是一个多功能蛋白，已报道其可参与病毒复制、移动、RNA沉默抑制等生理过程，但其在不同病毒中的功能并不保守。烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus, TbCSV）是双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒中的一种特殊致病类型，是引起烟草和番茄曲叶病的重要病原。前期研究发现马铃薯X病毒（potato X virus, PVX）介导TbCSV C3过表达可加重病害症状，但C3在TbCSV侵染过程中的生物学功能未知。本研究通过构建TbCSV C3突变体侵染性克隆、PVX介导C3系统过表达、pCV介导C3瞬时表达和创制C3过表达转基因材料，明确了TbCSV C3不影响病毒系统侵染，但在病毒侵染早期影响病毒症状形成，并增强病毒在寄主中的积累水平。通过构建C3截短突变体并以pCV和PVX载体分别进行瞬时或系统过表达，表明C3 123-129位氨基酸是其作为复制增强子必不可少的氨基酸序列。为探究C3促进病毒复制的机制及其与寄主因子的互作网络，通过比较转录组学分析C3调控的寄主基因，在TbCSV C3突变体侵染的本氏烟中，16条内源基因上调表达，7条下调表达。这些基因参与细胞代谢过程、刺激响应等生理过程，以及泛素化介导的蛋白水解、植物-病原物互作等生物通路。其中差异表达的NbNAC2基因受C3蛋白诱导表达，且病毒介导的NbNAC2基因沉默或过表达实验表明NAC2是TbCSV侵染的正调节因子。进一步通过酵母cDNA文库筛选与C3互作的寄主因子，共筛选到8个与C3直接互作的寄主蛋白，其中核纤维蛋白NbFib2与C3共定位于本氏烟细胞核核仁和卡加尔体，且NbFib2沉默可抑制TbCSV积累。以上研究结果表明，TbCSV C3蛋白能够促进病毒的复制并影响病毒侵染早期的症状形成；同时，C3蛋白能够以转录调节或蛋白互作的形式参与对寄主中多个生理路径的调控，其中对本氏烟NbNAC2基因表达的调控或与NbFib2蛋白的直接互作均可影响TbCSV的积累和侵染。本项目对TbCSV C3促进TbCSV侵染的作用机理的研究，进一步完善了C3的生物学功能，尤其是在C3与寄主因子互作网络构建方面的发现为解析C3通过调控寄主因子表达或功能进而影响双生病毒侵染的作用机理奠定了良好基础。