Evi1瘤基因高表达在鼻咽癌发病机理中的作用及其临床意义

我们采用微阵列比较基因组技术，发现瘤基因Evi1 DNA拷贝在鼻咽癌中扩增。随之发现Evi1蛋白质在大多数鼻咽癌细胞系和原发性癌组织中均有较强表达。采用慢病毒shEvi1感染Evi1高表达的鼻咽癌细胞，沉默Evi1蛋白，导致细胞体外增殖显著减缓，裸鼠体内致瘤性明显降低。进一步发现三氧化二砷（ATO，俗称砒霜）治疗鼻咽癌的机理与它对Evi1的降解相关。上述前期研究结果强烈提示Evi1在鼻咽癌发生和发展中起着十分关键的作用，并对鼻咽癌临床化疗有着重要影响。我们计划对Evi1的作用深入研究：1.阐明Evi1与EB病毒瘤基因EBNA3A在鼻咽癌发生中的相互关系；2.确定Evi1调控鼻咽癌干细胞的作用；3.阐明ATO对鼻咽癌的疗效与Evi1表达水平的关系，并论证ATO是第一个用于临床的抗肿瘤干细胞的药物。这些研究的结果将为阐明鼻咽癌发病机理，优化现有的鼻咽癌化疗方案以及开拓新的治疗方法做出重要贡献。

Evi1(Ecotropic viral integration site 1) 基因是作为逆病毒的整合位点，在患髓细胞样白血病的老鼠中被发现和鉴定，逆病毒的整合使Evil活化从而导致髓细胞样白血病的发生。在人类，由于染色体t（3;21）(q26;q22)的移位或inv（3）（q21q26）的倒位所致Evil异常表达被认为与慢性髓细胞样白血病（CML）、急性髓细胞样白血病（AML）的发生相关，Evil的持续高表达也被公认为AML的不良预后指标。此外在卵巢癌、结肠癌和肺癌等实体癌中也发现Evil高表达。这些证据表明Evil在肿瘤的起始和进展中起到重要的作用。..第一、我们发现Evi1瘤基因在鼻咽癌中扩增和高表达。用Affymetrix50K基因芯片对三个鼻咽癌细胞系（CNE1、CNE2和SUNE1）进行了分析，发现在鼻咽癌细胞株中3q26.2-3q26.3区出现4～6倍的扩增，该范围包括已知的瘤基因Evil但不包括在细胞生长死亡等多种过程中起关键信号转导作用的瘤基因PI3K，它刚好位于这一放大子的外侧。接着我们进一步发现Evi1在鼻咽癌临床标本和细胞系中高表达。第二、我们证实了Evi1对鼻咽癌细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响 1）经慢病毒shEvi1感染后，细胞生长减缓。2）沉默Evi1使细胞周期在G1/S期受阻。3）免疫印迹显示，沉默Evi1导致PARP蛋白裂解，表明细胞凋亡增加。 第三、我们发现Evi1对鼻咽癌干细胞的表型具有重要影响。shCtrl或shRNA慢病毒载体感染细胞后用Hoechst 33342染料染色, 用流式细胞仪分选。结果现示沉默Evi1后，1）使细胞侧群比例下降。2）使鼻咽癌细胞中ALDH活性下降。3）沉默Evi1抑制肿瘤球的形成。更为重要的是，我们发现Evi1 通过控制干细胞因子Nanog的表达从而调节肿瘤干细胞的表型。沉默Evi1后Nanog的表达降低。 第四、发现三氧化二砷（ATO）具有抗鼻咽癌肿瘤干细胞的作用，ATO促进Evi1降解和Akt磷酸化水平下降。 ATO抑制SUNE1细胞增殖的IC50为1.4 μM，而它在0.25 μM 低剂量便明显抑制鼻咽癌细胞的肿瘤球形成，表明ATO对鼻咽癌干细胞具有选择性的抑制。第五、通过focus 形成实验，软琼脂培养实验，以及裸鼠体内成瘤实验证明了Evil是鼻咽癌的转化基因。