可早期实时监测循环中转移性肿瘤细胞的在体流式图像细胞仪

This project is aimed to develop a novel biomedical optical instrument, in vivo imaging flow cytometry, to be applied to in vivo research of basic life science. The proposed instrument combines the techniques of high-speed imaging and conventional flow cytometry to realize dynamic and non-invasive monitoring of fluorescently labeled cells in circulation of small animals in real time, as well as quantitative analysis. We will focus on solving technical difficulties for instrumentation of "new cell counting method of in vivo flow cytometry" funded by NSFC project. We will optimize current optical layout, increase signal-to-noise ratio of detection system; add a new channel of 488 nm excitation to discriminate different cell types and analyze quantitatively; realize scientific instrumentation for the whole system; improve existing software by introducing wavelet-based algorithm and C++ programming to increase counting accuracy; obtain the velocity parameter of blood flow in vivo. Considering that fluorescence-based in vivo imaging flow cytometry can be only applied to small and superficial vessels, this project is going further to add photo-acoustic detection and endoscopic technique to develop in vivo photo-acoustic flow cytometry to detect deep and large vessels to enhance detection sensitivity of circulating tumor cells. We will also explore non-invasive label-free detection of circulating tumor cells in vivo by auto-fluorescence method.

本项目旨在研制在在体水平上用于生命科学基础研究的光学仪器“在体流式图像细胞仪”。该仪器在高速影像和体外流式细胞仪的基础上创新性地实现在体、实时、动态、无损监测小动物血循环内的荧光标记细胞(如循环肿瘤细胞)，并定量分析。项目拟解决在面上基金资助下发展起来的“活体流式细胞计数新方法”在仪器化方面的技术难点。改进现有光路，提高检测的信噪比；增加488nm 激发通道，实现对不同类型的细胞监测并定量分析；实现整个装置的科学仪器化；使用小波滤波和C++算法，提高计数准确率；并实现血流流速的在体分析。前期工作被国际肿瘤权威刊物Cancer Research接受并评价为突破性技术。目前基于荧光的在体流式图像细胞仪只能检测较为表浅的小血管, 项目拟通过与光声检测和内窥镜技术相结合,研制“在体光声流式细胞仪”，实现深层大血管检测，提高循环肿瘤细胞的检测灵敏度。并研究循环肿瘤细胞的在体无标记光学定量检测。

随着生物医学研究的进展，科研人员对循环细胞的无损实时监测提出了更高要求，如循环肿瘤细胞的检测等。本项目在前期国家自然科学基金（可实时监测循环流动细胞的在体流式细胞计数新方法，项目号：30770524）的工作基础上进一步研制在体流式图像细胞仪和光声流式细胞仪，实现了多通道、无创、实时监测动物模型中的循环细胞。信号处理部分是在体流式细胞仪的重要组成部分，其关键目标在于识别在循环系统中荧光标记的细胞受激辐射产生的信号峰，增加提高信噪比，提高提升数据分析准确性和运算速度，并实现实时及批量数据分析。 在我们的研究中，为实现对峰值进行识别，根据李普西兹（Lipschitz）指数，利用Morlet小波变换后信号的自相关奇异性，快速寻找峰值信息；并通过峰值峰宽判据及信号识别的回归处理，在保证精度的同时，将运行时间缩短了20倍，极大提高了搜索及识别效率。同时，在信号处理时采用分段方法优化解决信息量较大问题，使得分段与整体处理方法的运行时间基本相同。同时根据使用者操作分析时的需要，开发出了便捷友好的图形用户界面（Graphical User Interface, GUI），且实现了批量处理的功能,整体软件运用Matlab进行开发，其优点在于可利用自带的信号处理软件包如小波处理包，更准确迅速。整体软件已完成并申请软件专利。我们将在体流式图像细胞仪和光声流式细胞仪应用于循环肿瘤细胞的检测，发现了循环肿瘤细胞的出现时间点为泊松分布，且循环肿瘤细胞团块所占的比例随着肿瘤的进展不断提高，其终末期比例高于已有的报道。我们项目的所完成的仪器为生物医学研究，尤其是循环肿瘤细胞的研究提供了新的技术手段，并利用其优势发现了其它技术手段难以观测的生命科学现象。本项目共发表论文25篇（SCI收录18篇，EI收录7篇），申请发明专利3项（已经公开），实用新型专利4项（2项已经授权），软件著作权1项。项目负责人在执行期间获得国家杰出青年科学基金，被选为国际光学工程学会(SPIE)Fellow。