新型ADAMTS13诱变体的结构与功能研究

The Tyr661 and/or Tyr665 sites of ADAMTS13(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type1 repeats-13)are mutated by site-directed mutagenesis.The eukaryocytes are transfected by new ADAMTS13 variants. The activity of ADAMTS13 variants are measured by FRETs-vWF73 assay,GST-vWF73 assay and vWF multimer analysis.And wide-type ADAMTS13 and normal human plamsa are as controls of all tests.Through the horizontal case study,the activity of ADAMTS13,the titer of anti-ADAMTS13 autoantibodies and the distribution of vWF multimer in thrombotic thrombocytopenic purpura(TTP) patients plasma are measured and analyzed.Whether the anti-ADAMTS13 autoantibodies can neutralize and inhibit the activity of ADAMTS13 is tested by IgG binding and inhibition assay.The study may provide a new therapy method which is economic,effective and safe,set up the profile of anti-ADAMTS13 autoantibodies and provide a diagnostic basis of laboratory for TTP patients.The study has the theoretical significance and will make the greatly social and economic value.

本课题利用定点诱变技术，对ADAMTS13（血管性血友病因子裂解蛋白酶）Tyr661、Tyr665进行单位点或双位点联合诱变，同时转染真核细胞。以野生型ADAMTS13和正常人混合血浆为对照，检测诱变体对FRETs-vWF73（荧光标记vWF73）和/或GST-vWF73(谷胱甘肽S转移酶标记vWF73)及超大分子量vWF多聚体的裂解活性。通过横向研究，分析血栓性血小板减少性紫癜（TTP）患者血浆中ADAMTS13活性、抗ADAMTS13自身抗体及vWF多聚体组分分布与患病类型及病情程度的关系。利用IgG结合与抑制试验，观察TTP患者血浆中自身抗体是否中和诱变体及是否抑制其裂解活性。该研究将可能为部分TTP患者及其他动脉血栓性疾病患者提供新的、经济有效的、安全性更高的治疗手段，同时建立TTP患者抗体谱并为其提供实验室诊断依据。不仅具有重大的理论意义,而且将产生极大的社会和经济价值。

血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura,TTP)，是一种微血管血栓形成性疾病，临床上发病急骤、病程凶险、病死率高达90%。TTP可分为三类：遗传性、特发性和非特发性TTP。其中遗传性和特发性TTP均是由于ADAMTS13（A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type1 repeats-13）即血管性血友病因子裂解金属蛋白酶活性降低所致。前者是由于基因突变导致血浆ADAMTS13活性几乎为零，后者则主要是由于抗ADAMTS13自身抗体抑制酶活性。目前血浆输注或置换为TTP首选且唯一有效的治疗方法，可将死亡率降低至20%。然而血浆置换或输注过程中，可能出现过敏反应，低钾血症，特别是反复多次血浆置换会大大提高感染机会，进一步加重经济负担甚至导致治疗失败。本课题利用定点诱变技术，对ADAMTS13（血管性血友病因子裂解蛋白酶）Tyr661、Tyr665进行单位点或双位点联合诱变，同时转染真核细胞。以野生型ADAMTS13和正常人混合血浆为对照，检测诱变体对FRETs-vWF73（荧光标记vWF73）和/或GST-vWF73(谷胱甘肽S转移酶标记vWF73)及超大分子量vWF多聚体的裂解活性。通过横向研究，分析血栓性血小板减少性紫癜（TTP）患者血浆中ADAMTS13活性、抗ADAMTS13自身抗体及vWF多聚体组分分布与患病类型及病情程度的关系。利用IgG结合与抑制试验，观察TTP患者血浆中自身抗体是否中和诱变体及是否抑制其裂解活性。该研究将可能为部分TTP患者及其他动脉血栓性疾病患者提供新的、经济有效的、安全性更高的治疗手段，同时建立TTP患者抗体谱并为其提供实验室诊断依据。不仅具有重大的理论意义,而且将产生极大的社会和经济价值。