溶纤维素粘细菌生长发育中纤维素酶基因的时空表达与功能研究

溶纤维素粘细菌纤维堆囊菌能够利用结晶纤维素为唯一碳源生长，并进行粘细菌独特的形成子实体和粘孢子的复杂细胞行为和发育过程。我们在基因组序列基础上开展的纤维素酶分析中发现其纤维素酶系种类和数量组成及基因分布的独特性，显示其具有新颖的纤维素降解策略。本项目拟以纤维堆囊菌Sce0157-2 基因组中数量众多、序列结构多样、影响结晶纤维素利用效率的内切葡聚糖酶基因为靶点。利用异源活性表达解决酶组分的分离障碍，为生化性质研究和特异抗体制备提供材料。在本源菌中，通过基因转录分析构建酶组分在生长发育过程中的表达时序，阐释其生理功能。通过对细胞原位和分级分离组分的免疫标记分析，构建酶组分的细胞空间定位图。结果将对内切纤维酶在纤维堆囊菌分化发育和纤维素利用中的功能和策略提供实验证明。

在基因组水平上对S.cellulosum内外切葡聚糖酶基因深入分析发现一些独特而具有普遍性特征。近一半的酶具有脂蛋白信号肽，或以脂蛋白形式存在于细胞内、外膜上。酶分子中具有聚丝氨酸等特殊序列。极少有CBM，存在着不明功能长短不一的氨基酸区域。部分酶特征结构域不典型，难于归类于糖苷水解酶家族等。本项目目前实现了6个目的基因的异源活性表达，纯化了重组蛋白，对重组酶的基本生化性质包括温度和pH、金属离子和化学试剂对酶活性的影响，酶的底物特异性，作用底物后的产物，一些酶动力学常数等进行了研究。还对其中一些基因的特殊性进行了较深入研究，如GH5A的耐盐性和ScCel9E不同结构域的功能等。分析显示，So0157-2的不同基因表达的重组蛋白其最适温度最低30℃，最高的达到55℃.最适pH为中性偏微酸性，具有广泛的pH稳定区域。最适作用底物及可作用底物差异明显，产物的链长也有一定差异，这可能是多组分存在的原因之一。表达时序实验结果的重要一点是显示，该菌相关基因的表达似乎不受葡萄糖存在的影响，没有显示出产物阻遏效应。酶组分细胞定位研究结果显示，对于基因组中唯一的目的蛋白，利用其异源表达的活性蛋白制备的多克隆抗体在本源菌中的免疫定位中具有良好的特异性和分辨效果。否则易于产生交联反应，结果歧义较大。我们建立了细胞组分分级分离，酶谱定位，质谱鉴定，结合基因组信息的分析的方法，已实现一些蛋白的初步定位。本课题结果提供了一些可靠的实验证据，加深了对纤维堆囊菌内外切纤维酶生理功能的认知。