Numb蛋白介导PLC-PKC信号通路在锰神经毒性中的作用机制研究

Chronic exposure to manganese can impair the function of learning and memory, but the molecular toxicological mechanism remains unclear. Previous research show that the decreased expression of Numb is closely related to cognitive dysfunction. Moreover, conditional deletion of Numb in cerebellum purkinje cell can inhibit the expression of the type 1 metabotropic glutamate receptor (mGlu1) and mGlu1-dependent LTD, then impair the function of learning and memory. Recently, our animal experiments revealed that manganese exposure may impair learning and memory by inhibiting the hippocampal cAMP-PKA-CREB signaling pathway, the signaling pathways downstream of mGlu1, in rats. Coincidentally, CREB is also the downstream protein of the PLC-PKC signaling pathway, the signaling pathways downstream of mGlu1. However, there are no reports showed that whether manganese can affect the expression of Numb protein, thereby inhibiting PLC-PKC signal transduction pathway and induce the expression change of CREB and apoptosis protein, then resulting in the decrease of learning and memory function in the body. Therefore, this study combines cell and animal experiments, and use Morris water maze test, western-blot and ICP-MS to investigate whether the PLC-PKC signaling pathway were associated with Mn-induced cognitive deficits. We hope that we can explain the mechanism further and find new research orientation of manganese exposure through this study.

慢性锰暴露可导致机体学习记忆功能下降，但其分子作用机制尚未十分清楚。有研究表明Numb蛋白表达下降与机体认知功能障碍密切相关；条件性敲除Numb基因会特异性地下调突触内mGlu1的表达，造成浦肯野细胞LTD缺失，进而损害机体认知功能。我们最近的动物实验也揭示了锰可抑制mGlu1下游信号通路cAMP-PKA-CREB的信号转导，从而损害大鼠学习记忆功能。而CREB也是mGlu1下游PLC-PKC信号通路的转录因子，锰是否可影响细胞Numb及mGlu1的表达，从而抑制PLC-PKC信号通路的信号转导，诱导CREB及凋亡蛋白表达改变，进而导致细胞凋亡及机体学习记忆功能下降，目前未见报道。本研究拟通过细胞和动物实验相结合的方法，采用Morris水迷宫、western-blot及ICP-MS等技术和方法探讨PLC-PKC信号通路在锰神经毒性中的可能作用，为锰神经毒性研究及防治工作提供科学依据。

广西从事锰作业的职业人员众多，是我国锰中毒的高发地区之一。国内外大量研究指出锰可损害机体学习记忆功能，但其分子作用机制尚未十分清楚，且尚缺理想的锰暴露及其神经毒性生物标志物。本研究通过开展体内动物及体外细胞实验，采用Morris水迷宫、WB及ICP-MS等技术和方法探讨锰暴露对大鼠学习记忆功能的影响，研究PLC-PKC信号通路在锰致大鼠学习记忆功能损害的作用，并探索锰暴露及其神经毒性生物标志物。慢性及亚慢性锰暴露动物实验结果显示：①锰暴露可损害大鼠学习记忆功能，并导致大鼠锰累积暴露剂量及海马、毛发和血浆锰含量升高，毛发锰含量与锰累积暴露剂量和海马锰含量成正相关；②停止锰暴露后，高剂量组海马及毛发锰含量仍高于对照组，而血浆锰含量逐渐恢复正常；③海马及毛发锰含量与逃避潜伏期成正相关，与穿越平台次数成负相关；④随着锰暴露剂量的增加，海马Numb、mGluR1、PLC-γ1、PKC-β1、pCREB和Bcl-2蛋白表达随之下降，其蛋白含量与海马锰含量及逃避潜伏期成负相关，与穿越平台次数成正相关；⑤随着锰暴露剂量的增加，海马Bax蛋白表达含量和Bax/Bcl-2比率随之升高，其与海马锰含量及逃避潜伏期成正相关，与穿越平台次数成负相关。以上结果提示海马锰含量升高与锰致机体学习记忆功能损害密切相关，锰通过下调海马Numb蛋白表达，并特异性地下调海马mGluR1的蛋白表达，进而抑制mGluR1下游的PLC-PKC信号通路蛋白表达，诱导pCREB及凋亡蛋白表达改变，从而损害大鼠的空间学习记忆能力；毛发锰含量可反映海马锰含量情况，其有望作为锰暴露及其神经毒性的生物标志物。在大鼠海马神经元原代培养细胞实验中，通过加入PKC激动剂PMA，初步正反向验证了PLC-PKC信号通路可能在锰神经毒性中发挥了重要作用，为锰神经毒性研究及防治提供科学依据。