茶树咖啡碱合成相关基因的关联分析及功能标记开发

咖啡碱是茶叶重要的风味物质及生理活性特征成分。为从基因组水平上探索茶树咖啡碱表型差异的分子机理，并充分挖掘和利用我国茶树丰富的基因资源，拟从国家种质杭州茶树圃的资源中选取200余份核心种质和咖啡碱特异材料，利用EcoTILLING技术结合测序研究咖啡碱合成酶基因1、咖啡碱合成酶基因2及S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因等的核苷酸多态性和连锁不平衡结构，在分析这些材料的群体结构和鉴定咖啡碱含量的基础上进行关联分析，挖掘出与咖啡碱含量相关的功能多态性位点及效应，并筛选优异等位变异及相应材料，同时开发与咖啡碱含量显著相关的功能标记。本研究的顺利实施将可以明确茶树中的咖啡碱合成途径中3个重要基因的等位基因资源、功能多态性位点及其对咖啡碱含量的效应，得到的功能标记是一种稳定的遗传标记，为亲本选配、目标株早期鉴定、缩短育种周期和提高选育效率奠定基础。

从国家种质杭州茶树圃选取了代表性的405份茶树资源，通过两年、春秋两季的重复鉴定，明确了我国茶树资源生物碱的变异情况，筛选出了高咖啡碱、低咖啡碱高苦茶碱和低咖啡碱高可可碱等3类、8份特异资源，其中1份资源的苦茶碱含量高于现有文献报道。新开发了109对EST-SSR标记对565份材料进行了遗传多样性分析，从中筛选出适合关联分析的213份代表性资源，并明确了群体遗传结构。研究发现茶树咖啡碱代谢相关基因结构复杂，分别克隆得到SAM、TIDH和NMT基因家族中的9个、5个和6个基因成员包括启动子区域的DNA序列全长，已向NCBI提交11条新基因（JX647690~JX647700）。明确了茶组植物中TCS1因启动子区域的插入缺失和起始密码子ATG突变，存在6种类型的等位变异，其中3种与已克隆的TCS1、PCS1和ICS1的cDNA序列一致，也首次明确了这三种基因在DNA序列上的差异，另3种是新发现的等位变异。只在12份资源中筛选到B~F类型的等位变异。发现仅存在A类型等位基因时，茶树咖啡碱的含量都高于1.7%，表明用常规资源做亲本将很难选育出低咖啡碱品种。研究发现与咖啡碱合成相关的TCS1、TCS2和TIDH3等3个基因有中等程度的核苷酸多样性，并受负向选择影响；连锁不平衡在基因内部已迅速衰减至很低水平（r2＜0.2），表明基于候选基因的关联分析适用于茶树遗传分析。通过关联分析明确了在TCS1中存在2个功能SNP，对咖啡碱的遗传效应在5.15%~23.11%，而TCS2和TIDH3中无功能多态性位点。新开发出可用于筛选高咖啡碱资源和高可可碱资源的分子标记各1个。此外，提出了2种低咖啡碱育种新思路，并已于2012年秋开展了育种实践。利用本项目，已培养硕士研究生1名。已发表SCI论文4篇（影响因子＞2.0的2篇），中文核心期刊论文4篇，会议论文2篇，参加2次学术交流活动并做分会场报告。现已完成了计划研究内容，实现了预期目标。