茶树特异TCS1等位变异的深度挖掘与功能解析

Caffeine is an important characteristic component and makes important contribution to the quality and function of tea, which has been the important goal of tea breeding. TCS1 is a key gene involved in caffeine biosynthesis pathways of tea plant. In previous studies, alleles with different catalysis function or expression levels have been found in few special germplasms. While more rare alleles have not been isolated in other germplasms, the transcription regulation and genetic mechanism of TCS1 is not clear yet, these limit the effective utilization of specific tea germplasms. In this study, we will mine special TCS1 alleles in more tea germplasms. Special TCS1 alleles will be introduced into the E. coli cells and induced to express the functional proteins. To analyze the transcriptional mechanism of TCS1, different promoters will be fused to the GUS reporter gene in a plant expression vector and transferred into Arabidopsis thaliana. In addition, TCS1 genetic effects and the genotype of special germplasms with extraordinary caffeine content will be evaluated by using two F1 segregating populations which created by parents with special alleles. This study will help us understand the function and genetic mechanism of TCS1 allelic variations involved in caffeine biosynthesis of tea plant more deeply, which has important scientific significance and application value for tea breeding.

咖啡碱是茶叶中的重要特征成分、品质成分和功能成分，一直为茶树育种改良的重要目标。TCS1是茶树咖啡碱合成途径中的关键基因，前期研究发现其在少量特异资源中存在着数种酶活性或表达水平显著不同的等位变异，但目前TCS1等位基因尚未得到充分挖掘,TCS1的表达调控和遗传机制也不明确，这些限制了特异资源的有效利用。本项目拟在丰富的茶树资源中分离更多的特异TCS1等位基因，利用体外融合表达明确其编码蛋白功能。通过构建不同TCS1等位基因启动子的含GUS基因的表达载体，转基因拟南芥研究启动子活性差异。利用2个由父母本均含有特异TCS1等位基因的资源构建的F1分离群体研究TCS1的遗传效应，明确决定特异种质咖啡碱性状的基因型。本研究将深入解析TCS1等位变异在茶树咖啡碱合成代谢中的作用机制，对特异咖啡碱育种具有重要的科学意义和应用价值。

咖啡碱是茶叶重要的功能性成分之一，具有兴奋和刺激神经的作用，但是过量的摄入会使一些敏感人群出现失眠焦虑等。因此，保持茶叶应有风味和营养价值的低咖啡碱茶和茶制品受到了特殊需求消费群体的青睐。从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位基因，并研究其功能和转录调控模式，有助于深入解析茶树咖啡碱合成和调控机制，为低咖啡碱育种提供新的基因资源和理论基础。本研究新报道了不含咖啡碱的红芽茶和富含苦茶碱的白芽茶等2类嘌呤生物碱组分特异的野生茶树资源，其中红芽茶的研究结果获得了经济学人等多家国际媒体的关注。从673份茶树资源发现鉴定筛选到3个新的TCS1稀有等位基因，分别命名为TCS1g、TCS1h和TCS1i。克隆了8种TCS1稀有等位基因超2190bp的启动子和编码区序列全长，发现他们的基因结构都是由3个内含子和4个外显子组成。原核表达的结果表明TCS1g和TCS1i仅具有可可碱合成酶活性（TS）；TCS1h具有TS活性和咖啡碱合成酶活性（CS）。定点突变实验发现第153、225和269等3个氨基酸残基对咖啡碱合成酶活性有重要影响，其中第225位氨基酸决定TCS1是否具有咖啡碱合成酶活性。拟南芥稳定表达的GUS组织化学染色结果表明TCS1e和TCS1f的启动子活性较低，TCS1a启动子5’端片段缺失突变实验发现-331--178bp是启动TCS1转录的基础区段，并通过点突变实验鉴定到了一个关键顺式作用元件G-box。鉴定得到了影响苦茶碱合成的关键基因，并开发了一个功能标记可用于低咖啡碱、高苦茶碱茶树育种。明确了TCS1的遗传效应，筛选出6种合成咖啡碱水平低的TCS1等位变异，并在育种实践的基础上提出了高效创制两类低咖啡碱茶树新种质的技术路径。此外，通过本研究的开展实施，为今后的低咖啡碱和高苦茶碱育种积累了丰富的优异资源和育种中间材料。共发表第一标注相关论文3篇，其中SCI论文2篇，中文核心期刊1篇，授权植物新品种权1件，培养硕士生1名。