春兰花形相关基因的关联作图及其功能标记开发

Spring orchid （Cymbidium georingii）is the one of Chinese orchid with a long history of cultivation and a wide distribution in China. Floral morphology of spring orchid is one of the important content on orchid appreciation and the improvement of its morphology is also one of the major objectives in spring orchid breeding. Seven genes of ABCDE model were selected for intensive study since they play important roles in development of floral organ. One hundred accessions were selected according to their floral morphology. They will be exposed to analysis of linkage disequilibrium and genetic diversity with 50 documented molecular markers,EST-SNP and EST-SSR markers in house. Association between candidate marker alleles and floral morphology will be identified, and effect of marker allele will be analyzed. Then, functional markers will be developed on basis of association analysis and will be confirmed by the accessions. The functional markers will be very useful in selecting parental combination, early identifying a variety with interesting floral morphology for molecular assisted selection (MAS). The MAS with these markers will eventually shorten the period and raise the efficiency in spring orchid breeding.

春兰是国兰中栽培历史最为悠久，分布最为广泛的一种。花形是鉴赏春兰的一个重要内容，也是春兰培育的重要目标之一。本课题选取春兰花器官形态发育中的7个重要基因，它们涉及到花器官形态发育ABCDE模型中的主要环节。利用本研究所丰富的春兰基因资源，选取100余份核心种质，研究这些基因核苷酸多态性和连锁不平衡结构，同时利用本实验室开发的基于EST的分子标记(包括SSR和SNP)和已经报道的分子标记控制这些材料的群体结构的影响，然后对7个基因等位变异和花结构形态学特征进行关联分析。挖掘出影响花形态结构的功能多态性位点并分析其效应、筛选感兴趣的等位变异、开发与其相关的功能标记。得到的功能标记是一种稳定的遗传标记，在改良春兰花形时，可用于亲本选配、目标株早期鉴定，为缩短育种周期和提高选育效率奠定基础。

春兰花形是鉴赏春兰的一个重要内容，也是春兰培育的重要目标之一。研究者对兰属的植物进行转录组测序，并进行了大量生物信息学分析，发现了7,936个基因内部SSR(genic-SSR)位点，通过严格的参数设置选取其中80个genic-SSR位点进行标记开发，最终挖掘到其中55个genic-SSR标记呈现可扩展性且有多态性。利用这些开发的分子标记与先前报道的分子标记对种质资源库进行了遗传背景的分析，发现研究的春兰资源库中存在不同的五种不同的遗传背景。同时，利用这些测序信息克隆了七个与花发育相关的基因，这些是经典花发育模型中至关重要的基因，利用改良的关联分析模型对这些重要候选基因的变异以及表达量的差异研究发现其中C类基因AG的不表达直接导致了兰花的多层瓣形现象。为了全面了解兰花花发育的分子调节机制，研究者利用蛋白双向电泳技术，发现30个兰花特殊结构“唇瓣”相关的蛋白，提取差异蛋白并进行了质谱(MALDI-TOF/TOF) 分析并结合本地转录组数据库对比分析鉴定到了21个蛋白，发现其中在细胞壁形成中起作用的木葡聚糖转移酶(XET/XTH)与兰花“唇瓣”结构的形态学建成有关。小RNA测序发现48个成熟保守的miRNA及其71个对应前体。另外，还发现了包括两个miRNAs*在内的新miRNAs，以及28个对应前体。在表达分析中，利用荧光定量和转录测序数据确定有七个miRNA在两个不同花发育时期中有差异表达，其中miR159作用于花发育调节的激素应答因子，还有miR156、miR172和miR5179通过作用于花发育中起重要作用的MADS基因调节兰花形态学建成。这些调控花形态结构的基因、蛋白以及miRNA，可用于分子辅助选择的标记开发。这些基因的信息可用于春兰花形改良的亲本选配、目标株早期鉴定、为缩短育种周期和提高选育效率奠定基础。同时，这些包括转录水平到蛋白水平的立体分子调控信息为后续研究花形形态学建成的分子机理奠定基础。