青环海蛇免疫调节肽Hc-CATH抗耐药菌感染的分子机理研究

Immunotherapy is a promising treatment for drug-resistant bacterial infections. Hc-CATH, an immunomodulatory peptide identified from sea snake, possesses novel immunomodulatory mechanism. It inhibited the LPS-induced inflammation by competitive binding to the TLR4/MD2 receptor on the membrane surface of macrophages. Besides, it significantly reduced the mortality and bacterial load in MRSA-infected peritonitis mice. And it induced the production of chemokines in macrophage, enhanced the bactericidal ability of macrophage, and induced the formation of neutrophil NETs. Accordingly, we speculated that Hc-CATH kills the drug-resistant bacteria through inducing the chemotaxis of phagocytic cells and enhancing their phagocytosis. In order to confirm the hypothesis, in the present project we will firstly study the function and mechanism of Hc-CATH in inducing macrophage and neutrophil chemotaxis and chemokine expression in cells and mice model. And then, the functions of Hc-CATH in inducing phagocytosis, respiratory burst, and antimicrobial peptide and protein expression of macrophages and neutrophils will be studied. Finally, the mechanisms of Hc-CATH in enhancing the phagocytosis and bactericidal action, especially the mechanism of inducing NETs formation will be studied. Through the present project, we expect to provide templates and theoretical supports for the design of immunomodulatory peptide drugs against drug-resistant bacterial infections.

免疫疗法治疗耐药菌感染潜力巨大。我们从海蛇体内发现的免疫调节肽Hc-CATH作用机制新颖，通过竞争性结合巨噬细胞膜表面TLR4/MD2受体抑制LPS诱导的炎症。此外，该多肽能显著降低耐甲氧西林金葡菌感染小鼠的死亡率和体内细菌负荷量，诱导巨噬细胞趋化因子表达并提高其吞噬杀菌能力，诱导中性粒细胞外陷阱（NETs）形成。据此我们推测：Hc-CATH通过诱导吞噬细胞趋化并提高细胞吞噬杀菌能力的双重机制杀灭耐药菌。为证实该推测，本课题将首先从细胞和动物模型水平研究Hc-CATH体内外诱导巨噬细胞和中性粒细胞趋化及趋化因子表达的功能及其机理；进一步研究其对细胞吞噬、呼吸爆发和细胞内抗菌多肽和抗菌蛋白表达的影响；最后研究其提高细胞吞噬和杀菌能力的机理，特别是促进NETs形成的机理。通过本课题，期望为抗耐药菌感染免疫调节肽药物的设计提供分子模板和理论支持。

研发新型抗耐药菌感染新药和治疗方法是当前医学领域研究热点之一。免疫疗法是一种极具前景的新型抗耐药菌感染疗法，其中多肽类免疫调节剂种类和机制多样，活性强，开发潜力巨大。在前期研究中申请人团队从青环海蛇体内发现的宿主防御肽Hc-CATH表现出极强的免疫调节活性，在耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染所致的小鼠腹膜炎模型中表现出极强的抗感染活性，具有较大的开发潜力。本项目在前期工作基础上，进一步深入研究了Hc-CATH抗MRSA感染的分子机理。我们首先通过序列剪切和C末端酰胺化的方法，设计得到13种Hc-CATH改造体多肽（HC1-HC13），并对其抗菌活性、抗炎活性和毒性进行了研究，结果表明HC1-HC3抗菌活性最广谱高效、抗炎活性最强、毒性较低，因此筛选HC1作为模板进行进一步结构改造研究。进一步利用D-型氨基酸替换的方法设计得到2种改造体多肽（HC1-D1和2），其中HC1-D1为无规则结构，而HC1-D2为典型α-螺旋的对映异构体。稳定性实验结果表明2种改造体多肽的稳定性显著提高。活性实验结果表明HC1-D2抗菌活性广谱高效，尤其是对包括MRSA在内的大量耐药菌抗菌效果极强，主要通过破坏细菌细胞膜杀死细菌；此外杀菌作用迅速；细胞毒性和溶血活性相对较低；具有极强的抗生物膜活性。免疫调节活性研究结果表明HC1-D2具有极强的抗炎活性，能够显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞多种促炎因子的表达，但HC1-D2同时能够诱导细胞趋化因子的表达，表明其具有较复杂的免疫调节功能。抗炎机制研究结果表明HC1-D2能够与LPS结合，从而抑制LPS诱导的炎症信号通路激活。体内实验结果表明HC1-D2对包括耐药性金葡菌在内的多种耐药菌感染都具有很好的治疗效果，能够显著降低小鼠体内细菌数量和促炎因子水平，提高小鼠存活率。此外HC1-D2能够显著提高小鼠体内细胞趋化因子水平，诱导单核/巨噬细胞和中性粒细胞向感染部位的趋化。通过本项目的实施，明确了Hc-CATH结构中影响其抗耐药菌感染功能的关键结构参数，部分揭示了其抗耐甲氧西林金葡菌感染的分子机理，为其进一步功能、机理、构效关系和新药开发研究奠定了基础。