青环海蛇cathelicidins家族抗菌肽Hc-CATH的构效关系研究

Cathelicidins are a family of important antimicrobial peptides in vertebrates. They are excellent templates for the design of novel peptide anti-microbial agents. However, some of them possess certain hemolytic activity, which limit their direct application. Previously, we cloned a cathelicidin gene encoding Hc-CATH from the venomous gland cDNA library of Hydrophis cyanocinctus Daudin. There is significant sequence difference between Hc-CATH and other cathelicidins. However, like other cathelicidins, Hc-CATH possesses strong and broad-spectrum antimicrobial activity and certain hemolytic activity. Based on the preliminary work, the fuction, structure and antimicrobial mechanism of Hc-CATH will be deeply studied. On this basis, molecular modification study of Hc-CATH will be carried out and the functions of modified peptides will be examined. Aim of the present project is to find the key amino acid residues which are important for Hc-CATH to maintain its antimicrobial and hemolytic activity, construct basis for its subsquent directional modification study and provide templates and theoretical support for the design of novel peptide anti-microbial agents.

Cathelicidins是脊椎动物体内一个重要的抗菌肽家族，其成员是设计新型多肽类抗微生物药物的优良模板。但由于许多具有一定的溶血活性，限制了它们直接的开发应用。我们前期从青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus Daudin）毒腺cDNA文库中克隆到一条cathelicidins家族抗菌肽基因。该基因编码的成熟肽Hc-CATH与已知cathelicidins家族抗菌肽氨基酸序列差异显著，但同样具有广谱高效的抗微生物活性和一定的溶血活性。本项目拟在前期工作基础上，对Hc-CATH的功能、高级结构和抗微生物机理进行深入研究，在此基础上对Hc-CATH进行分子改造,并对改造多肽的功能进行研究，找到影响Hc-CATH抗微生物活性和溶血活性的关键氨基酸残基位点，为其进一步的定向改造研究奠定基础，并为新型多肽类抗微生物药物的设计和改造提供分子模板和理论支持。

Cathelicidins是脊椎动物体内一类重要的抗菌肽分子，在宿主抵抗病原微生物侵袭的过程中发挥了重要作用。到目前为止，从不同脊椎动物体内已经发现数十种cathelicidins分子，但是海洋爬行动物来源的cathelicidins尚无报道。在本项目中，我们从海洋爬行动物青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus Daudin）中发现一种全新的cathelicidin分子，命名为Hc-CATH。Hc-CATH由30个氨基酸组成，其一级结构为KFFKRLLKSVRRAVKKFRKKPRLIGLSTLL。我们化学合成了Hc-CATH并首先利用圆二色谱（Circular dichroism spectroscopy）和structure modeling技术对其高级结构进行了研究，结果表明Hc-CATH在水溶性溶液中为无规则结构，但是在脂溶性溶液中为两亲性α-螺旋构型。Hc-CATH具有广谱高效的抗菌活性，其能够靶向细菌细胞膜导致细胞裂解死亡。此外，Hc-CATH十分稳定且对哺乳动物细胞毒性低。除了抗菌活性外，Hc-CATH还具有极强的抗炎活性。其能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞中细菌脂多糖LPS诱导的促炎因子的分泌，如NO、TNF-α、IL-1β、IL-6。Hc-CATH可以直接与LPS结合中和LPS毒性，此外其还可以结合到巨噬细胞膜表面受体TLR4/MD2复合物上，抑制LPS与TLR4/MD2的结合和下游LPS诱导的炎症信号通路的激活。.我们通过序列剪切和氨基酸残基替换的方法对Hc-CATH进行了结构改造，并对改造多肽的抗菌活性和溶血活性进行了研究。我们共获得了21种改造体多肽，其中大部分改造体多肽都具有较强的抗菌活性和较低的溶血活性，但随着序列的缩短，其抗菌活性逐渐降低，说明序列长度是影响其抗菌活性的一个重要因素。用非天然D-型氨基酸替换L-型氨基酸并未显著改变改造体多肽的抗菌活性和溶血活性，但可能会提高多肽的稳定性，需要进一步实验验证。