三氯乙烯药疹样皮炎特异T细胞受体的识别与鉴定研究

Trichloroethylene (TCE) caused medicamentosa-like dermatitis is a severe and life-threatening immune-related disorder with unclear pathogenesis. TCE and/or its metabolites induced combination of human leukocyte antigen HLA-B*1301 with self-peptide may be a critical step in the pathogenesis. However, another key process whether T cells recognize the HLA-B*1301-peptide complex by specific T cell receptor (TCR) and initiate the immune responses, has not been illustrated yet. To clarify it, we will first test if the variable domains of TCR α/β-chains (AV/BV) are skewed in peripheral CD8+ T cells of HLA-B*1301 allele carriers who suffered from relative to who were tolerant to the disorder by TCR repertoire spectrotyping, and then identify the specific TCR by sequencing the complementarity determining region (CDR3) from the skewed AV/BV using high-throughput deep sequencing technology. Thereafter we will verify the CDR3 sequences of the specific TCR in the same blood samples by quantitative real-time PCR, and further conduct an in vitro test of the cloned TCR containing the verified CDR3 in its recognition of the HLA-B*1301-peptide complex. This study will help to uncover the molecular pathogenesis of TCE-induced medicamentosa-like dermatitis, and may provide new directions for the prevention, diagnosis, surveillance, and treatment of the disorder.

三氯乙烯（TCE）所致药疹样皮炎是一种严重的免疫相关疾病。TCE和/或代谢产物诱导人白细胞抗原HLA-B*1301结合自体抗原肽可能是致病的关键环节之一。然而，另一关键环节——T淋巴细胞是否通过特异T细胞受体（TCR）识别HLA-B*1301-抗原肽复合物并启动免疫应答——尚未被阐明。本研究拟首先通过TCR库谱系分析比较携带HLA-B*1301基因的三氯乙烯药疹样皮炎患者与耐受性接触者外周血CD8+ T细胞TCR库α/β链可变区（AV/BV）分布差异，对疾病相关AV/BV进一步运用高通量深度测序检测其互补决定区CDR3的核酸序列，识别特异TCR；其次通过实时定量PCR在相同样本中验证特异TCR的CDR3序列，并通过体外克隆表达特异TCR对HLA-B*1301-抗原肽的识别实验做进一步功能鉴定。本研究有助于深入揭示三氯乙烯药疹样皮炎的发病机制，可能为该病的预防、诊断、监测、治疗提供新方向。

职业接触三氯乙烯（TCE）导致的药疹样皮炎是一种起病急、病情重、病死率高的免疫相关职业病，严重危害劳动者健康。探索三氯乙烯药疹样皮炎（OMDT）发生的免疫机制有助于该病的防治。先前研究表明TCE及活性代谢产物诱导人白细胞抗原HLA-B*13:01结合自体抗原肽可能是致病的重要环节；然而，T细胞如何通过特异T细胞受体（TCR）识别HLA-B*13:01-抗原肽复合物并启动免疫应答尚未被阐明。本项目通过运用高通量深度测序等先进分子生物学技术寻找限制性识别HLA-B*13:01-抗原肽复合物并启动免疫反应过程的特异TCR克隆型，从而解开OMDT发病机制的这一关键环节。项目采用等位基因特异性PCR筛选HLA-B*13:01等位基因携带者，随后选取携带HLA-B*13:01基因的10名病例和匹配的10名耐受性对照作为对象，进行TCR免疫组库高通量深度测序，获得CDR3核酸序列和相应的氨基酸序列。研究发现，病例组TCR β链CDR3库独特CDR3数、Shannon-Wiener指数和Simpson's diversity指数、高克隆扩增（HEC）数、HEC比率、HEC频率与对照组比较差异均无统计学意义，但上述指标标准差均明显高于对照组，可能与病例处于不同疾病状态有关。与对照组比较，病例组CDR3长度分布只在13AA时差异有统计学意义（P<0.05）。病例组TRBV6-3、TRBV6-4、TRBV25-1、TRBJ1-6使用频率均低于对照组，TRBV4-1、TRBV7-6使用频率均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，病例组33个TRBV-TRBJ基因组合频率增高，15个TRBV-TRBJ基因组合频率降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。通过进一步比较病例组和对照组外周血TCR库，发现17个TCR CDR3核酸序列和16个CDR3氨基酸序列可能为限制性识别HLA-B*13:01-抗原肽复合物的特异TCR克隆型。选取其中4个特异CDR3核酸序列，设计引物和探针进行PCR验证。通过PCR和ELISA方法检测病例和对照组HHV6、HCMV感染情况，结果显示携带HLA-B*13:01等位基因、特异TCR克隆、及HHV6、HCMV既往感染间存在显著关联，从而间接说明特异TCR的可能功能。本项目研究为OMDT的预防、诊断、治疗提供了新突破口，具有潜在应用价值。