淋巴毒素局部诱导三级淋巴器官发挥抗肿瘤作用及其机制研究

三级淋巴器官（TLO），是近年来在某些自身免疫疾病和移植物中发现的一种新生淋巴组织，其结构和功能高度类似于淋巴结和脾脏等二级淋巴器官。研究证实肿瘤内浸润淋巴细胞数量往往预示着更好的预后，那么，是否可以在肿瘤内直接诱生免疫功能更加完备的TLO组织? TLO在瘤内形成是否更有利于肿瘤抗原提呈和淋巴细胞浸润，从而有效地打破肿瘤的各种免疫屏障? 为了解决上述问题，本研究拟通过LT-α基因转染结肠癌细胞，在肿瘤局部建立稳定高水平表达LT-α的小鼠结肠癌肿瘤模型，观察LT-α的表达是否能够诱导结肠癌瘤内TLO形成，并研究其对肿瘤生长方式、生长速度、转移及模型存活率等肿瘤生物学特征的影响，在此基础上，深入研究瘤内TLO形成对各种在肿瘤免疫中具有重要作用的趋化因子和细胞因子的调节作用，探讨将LT-α作为诱导肿瘤TLO形成和抗肿瘤治疗方法的可行性，为寻找新型的结肠癌临床免疫治疗策略提供理论依据。

为了探究能否在肿瘤组织中诱导生成是否具有抗肿瘤作用的三级淋巴器官（TLO），我们通过慢病毒基因转染技术，将淋巴毒素α基因转染给小鼠结肠癌细胞系C26，成功构建稳定高表达LTα的肿瘤细胞系，然后接种给Balb/c小鼠。通过肿瘤细胞作为产生LTα的载体，营造异位高表达LTα的肿瘤微环境，以此来探究是否能在局部诱导生成三级淋巴器官。转染LTα基因的C26细胞、亲本细胞C26、转染空载体的C26细胞分别用于构建荷瘤模型，并分成三组。三组成瘤率满意，分别为C26 组 95.56%（43/45）， C26-空载体组 91.11%（41/45）， C26-LTα 组 88.88% (40/45）。然后将各组成瘤小鼠分成三部分，一部分用于观察和比较肿瘤生长动力学及生存期（每组15只），另一部分用于进行病理鉴定分析是否形成TLO（每组15只），剩下的一部分用于测定肿瘤组织中淋巴细胞成分及外周血趋化因子和细胞因子水平（每组10只）。结果显示，C26-LTα组肿瘤生长速度、肿瘤体积明显小于其余两组对照组，第3周时其肿瘤组织出现坏死区域并大量淋巴细胞浸润，第6周C26-LTα组肿瘤组织切片中可见淋巴细胞聚集成团，类似淋巴滤泡结构，经进一步免疫组化分析确定其包含：1）独立但相互毗邻的B细胞区和T细胞区；2）B淋巴细胞滤泡中形成生发中心；3）FDC细胞位于淋巴滤泡中并互相交织形成网络结构；4）在淋巴滤泡周围，可见PNAd+的HEV形成。实验结果表明，通过异位表达LT-α可在肿瘤环境中诱导生成三级淋巴器官。接下来，我们用流式细胞术对肿瘤组织中CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4+/CD8+比例，Treg占CD4+比例以及利用Elisa法检测外周血的自稳性淋巴趋化因子CXCL13、CCL19、CCL21以及正向免疫调节相关的细胞因子IFN-γ和负向免疫调节相关的细胞因子TGF-β的水平。检测结果发现C26-LTα组小鼠CD4+T细胞、CD8+T细胞数量显著高于对照组，而CD4+/CD8+比例、Treg比例显著低于对照组，外周血CXCL13、CCL19、CCL21、IFN-γ水平显著高于对照组，而TGF-β显著低于对照组，提示肿瘤组织中异位高表达LTα可能通过上调自稳性淋巴趋化因子来募集淋巴细胞进而形成三级淋巴器官，并且可能突破肿瘤对机体的免疫耐受而发挥正向的抗肿瘤免疫。