植物乳杆菌抗食源性致病菌抗菌物质的分离鉴定及抗菌机理初探

由于植物乳杆菌具有其他乳酸菌所无法比拟的抗菌物质多样性及极高的抗菌效能，因此备受人们关注。前期研究中，项目组已从云南传统发酵豆豉中分离得到22株植物乳杆菌，为本项目的实施提供了足够的研究材料。经分子生物学鉴定，它们分属2个近亲种，并且发现它们具有较好的抗常见食源性致病菌能力。同时发现它们均存在IIb类细菌素的编码基因，深入研究表明这些编码基因存在基因多态性，也存在近亲种间及地区差异性；通过对上述菌株培养上清的初步分离萃取表明，抗菌物质主要存在于乙酸乙酯和正丁醇相，由此为本项目的开展提供了理论依据与技术支持。本项目通过对不同植物乳杆菌近亲种的抗菌物质的分离鉴定，阐明它们抗菌物质的组成与结构的共性与差异性，并通过对抗菌物质的作用靶点的研究，初步探讨它们的抗菌机理。.项目研究不仅能发掘一批高效安全的植物乳杆菌资源，而且能为它及其代谢产物作为新型食品生物保藏剂的开发利用提供理论依据。

食品安全是世界各国普遍关注的焦点问题，安全、广谱和高效的天然食品防腐剂对于食品保鲜非常重要。植物乳杆菌具有抗菌物质多样性及极高的抗菌效能。本研究使用分子生物学方法分析了云南传统发酵食品中的微生物群落结构，分离得到的68株植物乳杆菌，分属于3个亚种，即Lb. paraplantarum，Lb. pentosus及Lb. plantarum subsp. plantarum。以常见食源性致病菌作为指示菌，采用琼脂扩散法对植物乳杆菌YM-4-3抗菌物质的抗菌谱进行鉴定，发现该菌株具有抑菌谱广、抑菌效果佳等特性。对植物乳杆菌QB3-3菌株的长时间抑菌效果观测显示，此菌株对大肠杆菌O157：H7和金黄色葡萄球菌均有长达96 h的抑菌效果。应用色谱技术与波谱学方法对非蛋白类抗菌物质进行分离鉴定，发现植物乳杆菌产生的非蛋白类物质主要为有机酸，其抑菌作用主要是以乳酸为主导。本研究建立了乳酸菌发酵液中DL-3-苯乳酸高效液相色谱快速检测方法。蛋白类抑菌物质（植物乳杆菌素）抑菌效果较差，但不改变食品口感和风味。我们对26株植物乳杆菌的10种植物乳杆菌素相关基因的多态性分析结果显示，抑菌效能与其编码的植物乳杆菌素基因的种类和数量有正关系。我们研究了植物乳杆菌YM-4-3菌株植物乳杆菌素相关基因（植物乳杆菌素转运系统（plnGHSTUVW）、植物乳杆菌素表达激活子基因（plnC）以及植物乳杆菌素基因（plnRL, plnJK, plnIEF））的表达情况与细菌素抑菌作用的相关性。在不含NaCl培养中，上述植物乳杆菌素相关基因未发现过表达，无抑菌效果。上述基因受到NaCl诱导，表达量普遍上升，在27 h达到最大值。我们对三株来自传统发酵食品的植物乳杆菌YM-5-2、YM-4-3和AY01进行了全基因组测序，通过植物乳杆菌细菌素相关基因测序分析，推测出YM-5-2植物乳杆菌素调控与作用模式及其编码基因的基本信息。电镜观察显示，植物乳杆菌抗病原菌主要机理为破坏细胞结构，改变菌体形态，使其细胞质流出，最终死亡，可以推测有机酸对细菌的作用靶点主要为细胞壁。按照国家标准，用植物乳杆菌及发酵产物对小鼠进行了急性毒性试验及致畸试验，小鼠没有出现任何中毒迹象以及畸形形态。该项目研究发掘了一批高效安全的植物乳杆菌资源，为新型食品生物防腐剂的开发利用提供了理论依据。