番茄果实成熟特异RING-H2 Finger型锌指蛋白LeRZFP1的功能分析及其调控机理研究

锌指蛋白在细胞分化、增殖、凋亡及植物抗逆性中起重要的调控作用。在研究番茄果实成熟过程中，我们克隆到一个果实成熟期特异性表达的RING-H2 Finger型锌指蛋白LeRZFP1基因，定量PCR分析表明，该基因主要在番茄果实成熟期大量表达，而在根、茎、叶、花和未成熟果实中表达较弱。本研究拟利用已克隆的番茄LeRZFP1基因，构建超表达和 RNAi沉默载体，转化番茄，获得LeRZFP1目标基因超表达和沉默的番茄转基因株系，研究LeRZFP1基因对番茄果实成熟、抗逆性和耐贮性的影响，深入研究番茄LeRZFP1的功能。利用合成的随机20碱基二聚体 DNA片段与凝胶移位结合分析技术，研究LeRZFP1 蛋白是否具有DNA特异结合域，并利用酵母双杂交技术和荧光共振能量转移法，研究LeRZFP1蛋白与其它蛋白的相互作用，进一步明确LeRZFP1蛋白在果实成熟、抗逆性和耐贮性中的分子调控机理。

锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的一类蛋白质。目前，已经在拟南芥、番茄、葡萄、水稻、矮牵牛、棉花、大豆等植物中相继分离了大量锌指蛋白基因，但大多数锌指蛋白基因的生物学功能尚不清楚。番茄是果实成熟研究的模式植物，锌指蛋白在番茄果实成熟过程中所扮演的角色到现在还少有报道。我们筛选到对番茄果实成熟时期特异转录表达的锌指蛋白基因LeRZFP1。定量PCR分析表明，该基因主要在番茄果实成熟期大量表达，而在根、茎、叶、花和未成熟果实中表达较弱。. 本研究构建了LeRZFP1基因特异的RNAi载体和超表达载体，通过农杆菌介导的方法获得了该基因沉默效果较好的3个转基因株系，由于该基因本底表达水平较高，过表达的转基因株系中该基因的表达效率并不明显。LeRZFP1基因沉默的番茄在breaker时期到breaker+7的时间里，果实表皮的色素积累速度明显低于野生型，尤其是在breaker+4的时期，这种色素积累的差异表现最为明显。然而随着果实成熟进程的进一步推进，果实表皮颜色的差异逐渐变小，到breaker+10时期逐渐趋于一致。这些结果表明LeRZFP1在调控番茄果实成熟时期色素的合成方面发挥重要作用。通过分析野生型和转基因番茄breaker+4、breaker+7和breaker+10时期的果实材料中黄酮和番茄红素的含量，发现在breaker+4时期，转基因番茄果实中番茄红素的含量明显低于野生型材料。这些结果说明LeRZFP1的沉默导致番茄果实番茄红素积累速度的降低。本研究利用qRT-PCR技术对果实成熟相关基因在mRNA水平进行了分析。相对于同时期的野生型材料，控制乙烯合成的结构基因（ACS1，ACS2，ACO1和ACO3）在转基因材料中并无明显变化，说明LeRZFP1基因的沉默对乙烯的合成没有明显的影响。另外受乙烯诱导的参与果实成熟过程中次生代谢产物合成的大部分基因在转基因材料中（PSY1, ZDS, PDS, E4, E8, PG, LOXA,PTI4, ERF1）也没有明显变化，除了LOXB以外。以野生型和转基因番茄breaker+4时期的果实为材料，利用RNA Sequence技术对全基因组的基因在mRNA水平进行表达分析。除LOXB外，与果实成熟进程明确相关的基因在转录水平都未有明显变化，说明LeRZFP1可能参与了果实成熟过程中不饱和脂肪酸的代谢调控。