重组日本七鳃鳗RGD毒素肽rLj-RGD3结构与抗血栓活性的关系

RGD toxin peptide, rLj-RGD3, is a novel recombinant protein from the buccal gland of Lampetra japonica (a kind of marine migratory fish), which contains three RGD (Arg-Gly-Asp) motifs in its primary structure. The gene of Lj-RGD3 was found in the buccal gland cDNA library of Lampetra japonica, and which was cloned and expressed. The purified recombinant rLj-RGD3 was prepared and used to study the antithrombotic effects of which. Previous studies have shown that, rLj-RGD3 has the functions of anti-platelet aggregation and anti-thrombosis (venous thrombosis and arterial thrombosis) due to the RGD motifs, but its bleeding side effects was slight. In order to study the role and mechanism of the three RGD motifs in anti-thrombotic activity, RGD motif deletion mutant of wild-type rLj-RGD3 will be performed, and the antithrombotic effects of wild-type rLj-RGD3 and mutations will be studied. The relationship between the anti-thrombotic functions and structure of Lj-RGD3, as well as the mechanism would be clarified if the project proceeds successfully. These results will be valuable to the proteomics and new marine genetic engineering drug studies of Lampetra japonica with scientific originality, important theoretical significance and broad application prospects.

重组日本七鳃鳗RGD毒素肽rLj-RGD3为源自于海洋洄游鱼类日本七鳃鳗口腔腺的可溶性蛋白，其一级结构含有3个RGD(Arg-Gly-Asp)模体。本课题前期于七鳃鳗唾液腺cDNA文库中发现其基因，对其进行了基因克隆、表达及重组蛋白的大量制备，并对其抗血栓功能进行了研究。先期研究结果表明，rLj-RGD3可凭借分子中含有的3个RGD模体而具有抗血小板聚集、抗动脉与静脉血栓形成作用，且出血不良反应小。为了研究其3个RGD模体的作用方式及其对抗血栓活性的影响，本课题拟对野生型rLj-RGD3进行RGD模体的缺失突变，并对野生型及各突变体蛋白的抗血栓作用进行研究，以确定其结构与抗血栓活性的关系及作用机制。本项目的立项与完成，将为七鳃鳗蛋白质组学与基因工程海洋药物的新药研究奠定理论基础，具有科学的原创性、重要的理论价值和广阔的应用前景。

重组日本七鳃鳗RGD毒素肽rLj-RGD3为源自于海洋洄游鱼类日本七鳃鳗口腔腺的可溶性蛋白，其一级结构含有3个RGD（Arg-Gly-Asp）模体。本课题前期于七鳃鳗唾液腺cDNA文库中发现其基因，对其进行了基因克隆、表达，并对其抗血栓功能进行了初步研究。为了研究其3个RGD模体的作用方式及其对抗血栓活性的影响，本课题对野生型rLj-RGD3进行RGD模体的缺失突变，并对野生型及各突变体重组蛋白的抗血栓作用进行研究，以确定其结构与抗血栓活性的关系及作用机制。.结果表明，野生型rLj-RGD3较缺失突变的4种突变体的抗血小板聚集及抗血栓活性均高，其仅含一个RGD模体的3种突变体活性相当，而将RGD模体全部缺失的突变体蛋白不具有抗血小板聚集及抗血栓活性。提示，3个RGD模体在抗血栓功能中不分伯仲，均十分重要，而rLj-RGD3因分子中含有3个RGD模体而活性最强。.深入研究rLj-RGD3的抗血栓作用及机制，结果证明，rLj-RGD3具有强大的抗动脉血栓、静脉血栓、混合血栓和血小板血栓作用。其抗栓作用与凝血系统和血液流变学无关，对凝血时间参数TT、PT、APTT、全血比黏度及血浆比黏度均无影响。其抗栓作用与抗血小板活性相关，抑制血小板聚集、黏附、释放活性，同时升高血小板内cAMP并降低血小板内游离钙[Ca2+]i浓度。可见，rLj-RGD3是抗血小板药。.为探讨其临床可能的适应症，研究发现，rLj-RGD3对大鼠脑缺血再灌注脑损伤及远隔器官肝、肺损伤具有明显的保护作用；对PC12细胞缺氧缺糖再灌注损伤具有明显的保护作用。rLj-RGD3对脑I/R脑损伤的保护作用与其激活细胞Integrin-PI3K/Akt抗凋亡通路有关；其对脑I/R致肝、肺损伤的保护作用与其提高抗自由基损伤能力有关。.本项目首次在日本七鳃鳗这一物种中发现并确认了RGD毒素蛋白抗血栓功能新基因，明确rLj-RGD3的抗血栓作用机制，探明rLj-RGD3的3个RGD模体在抗血栓功能中不分伯仲，均十分重要，而rLj-RGD3因含有3个RGD模体而活性更强，为rLj-RGD3的小分子改造提供理论依据，为七鳃鳗蛋白质组学与基因工程海洋药物的新药研究奠定理论基础，具有科学的原创性、重要的理论价值和广阔的应用前景。