电针刺激头部运动区调控PI3K/AKT信号通路对新生脑瘫鼠神经行为影响的机制研究

The research of this project is based on the former National Natural Science Foundation, which had demonstrated that phosphatidyl-inositide 3 kinase/Akt (PI3K/Akt) signaling pathways involved in cerebral ischemia or anoxia injury control. But it has yet to see related research reports about whether or not PI3K/Akt signaling pathways has regulatory effect on early pathophysiological mechanism in cerebral palsy; and clinical various rehabilitation methods, which can effectively improve the neural behavior disorders of cerebral palsy, whether or not has close ties to the PI3K/Akt signaling pathways has unreported either. After establishing neonatal cerebral palsy SD rat models, our research group use electroacupuncture motor area scalp projection of the rats, releasing conduction of impulse through the high impedance skull, in order to activate PI3K/Akt signaling pathways, and activate the direct target gene Akt of PI3K, then mediated various biological effects, regulate and control the growth, proliferation, survival, inhibiting apoptosis of nerve cells. It proves that the PI3K/Akt signaling pathways affects ischemia and anoxia pathophysiological process in the developing brain of neonatal cerebral palsy SD rat. At the same time, the intervention by PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002 and GSK-3β inhibitor LiCl will hopefully show that the important mechanism, using electroacupuncture head motor area effectively improve and recover the neurobehavioral disorders of cerebral palsy, is activate PI3K/Akt signaling pathways and intervene the "target spot" Akt. It provides new "target spot" for early treatment and rehabilitation of cerebral palsy in clinic, and offers new ideas for the research of cerebral palsy treatment by Chinese medicine.

本研究是前国家自然科学基金项目的继续与深入，以往研究已证实PI3K/Akt信号通路参与脑缺血缺氧损伤的调控。但其在脑瘫早期的病理生理机制中是否也有调控作用；改善脑瘫神经行为障碍的康复方法，是否与此信号通路有关未见报导。本课题拟构建新生脑瘫鼠动物模型，采用电针刺激运动区头皮投影，穿过高阻抗颅骨释放传导冲动，旨在激活PI3K/Akt信号通路，活化PI3K直接靶基因Akt,以介导多种生物学效应,达到调控神经细胞生长、增殖、存活和抑制凋亡之目的，从而证明PI3K/Akt信号通路影响新生脑瘫鼠脑缺血缺氧的病理生理过程；应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002及GSK3β抑制剂LiCl的干预，证实电针刺激头部运动区有效改善脑瘫神经行为障碍的重要机制是通过激活PI3K/Akt信号通路，干预"靶点"Akt来实现的。本研究为脑瘫康复提供可靠的理论依据，为针对信号通路和"靶点"探寻新的治疗方法提供思路。

本课题的研究目的：验证PI3K/Akt信号通路是否参与脑瘫鼠脑损害的病理生理过程，在电针刺激头部运动区有效减轻脑瘫鼠脑损害机制中的调控作用。方法：在成功构建脑瘫鼠动物造模基础上，设立正常组、模型组、头部电针组、头部电针+LY294002组、头部电针+ LiCL组。运用Western blot法检测海马组织p-PDK1、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β(ser9)、MCL-1的表达；RT-PCR检测PP2A的mRNA的表达；通过脑瘫鼠脑组织病理学观察脑瘫鼠神经元凋亡、神经细胞线粒体凋亡情况；按Bederson评分法，对神经功能进行评估，并与其他实验数据进行关联性分析；应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002及GSK3β抑制剂氯化锂（LiCl），验证PI3K/Akt信号通路是否参与脑瘫鼠的病理生理过程，以及在电针刺激头部运动区有效减轻脑瘫鼠脑损伤机制中的作用。结果：与空白组比较，模型组不同时间段均表现为运动功能评分较低，海马组织p-PDK1、p-Akt的蛋白表达明显减少,神经元凋亡较多；与模型组比较，头部电针组的运动功能评分在各时段都较高，海马神经细胞凋亡减少，海马组织p-Akt、p-PDK1、p-GSK-3β(ser9)、MCL-1 的表达明显，有显著差异（P＜0.05），说明电针刺激头部运动区可提升脑瘫鼠诱导的p-Akt和p-PDK1低表达，调节Akt及其作用底物GSK-3β的磷酸化水平，从而改善和恢复神经行为障碍；头部电针+LY294002组与模型组各项观察结果相近，与头部电针组比较差异明显（P＜0.05），说明LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,抵消了电针对脑瘫鼠大脑干预保护作用；头部电针+ LiCL组各项观察结果与头部电针组相近，在第14天、21天更具有良好的发展趋势，说明电针联合应用LiCL处理后，可进一步激活PI3K/Akt/GSK-3β信号传导通路，抑制GSK-3β的活性,对神经保护有叠加作用。结论：电针刺激头部运动区对脑瘫鼠大脑缺血缺氧性损害具有保护作用；PI3K/Akt信号通路参与脑瘫鼠脑损害的病理生理过程；PI3K/Akt信号通路在电针刺激头部运动区有效减轻脑瘫鼠脑损害、恢复神经运动功能机制中起着重要作用。为临床脑瘫儿的早期治疗与康复提供了新的作用“靶点”，为开展脑瘫治疗与康复方法与机制的研究开辟了一条新路。