电针刺激通过GDNF-Ret及PTEN/PI3K/Akt信号通路促进ENS修复的机制研究

Deletion or serious injury of enteric nervous system (ENS) neurons in the gastrointestinal tract is the pathogenesis of a variety of gastrointestinal motility disorders. The difficulty in regeneration of ENS is the key reason which hinders the therapeutic efficacy of diseases related to gastrointestinal dysmotility. Our previous study found that electroacupuncture could repair the damaged ENS neurons, thereby increasing the gastrointestinal motility, which through GDNF and PI3K/Akt signaling pathway. However, the further mechanism of electroacupuncture on ENS repairment is not clear. Studies showed that intestinal endogenous neural stem cells (ENSCs) and bone marrow stromal stem cells (BMSCs) may play an important role in ENS regeneration and repairment of damaged neurons, the intestinal micro environment, especially neurotrophic factor GDNF and its related signal pathway plays a critical role in it , which can make the two kinds of stem cells’ effects become synergistic and complementary, and also play an importment role in the repair of damaged ENS neurons. On the basis of our previous work, this project intends to investigate whether electroacupuncture is affected thorugh GDNF-Ret, PTEN/PI3K/Akt signaling pathway, influence the synergistic effect of ENSCs and BMSCs, and promote the repairment of damaged neurons and regeneration of neural stem cells, also to explore the role of EphrinB/ephB signaling pathway on the repairment of nerve function. Study on the mechanisms of electroacupuncture promoting the repair of ENS is needed, as electroacupuncture provides a new theoretical basis for the treatment of gastrointestinal motility disorders.

ENS神经受损或缺失是多种胃肠动力障碍性疾病的发病机制，ENS损伤后的修复困难是阻碍这类疾病治疗效果的重要原因。我们前期研究发现电针足三里可促进损伤ENS神经修复，增加肠动力，GDNF及PI3K/Akt信号途径参与其中。但是，电针如何促进ENS修复的深入机制尚不明确。研究表明，肠源性神经干细胞（ENSCs）和骨髓基质干细胞（BMSCs）可能在ENS再生中起重要作用，肠道微环境尤其是GDNF及相关信号通路起至关重要的作用，可使两种干细胞协同互补，并对损伤的神经元有修复作用。本项目拟在我们前期工作基础上，研究电针刺激是否通过影响GDNF-Ret、PTEN/PI3K/Akt信号通路，进而诱导ENSCs和BMSCs的协同作用，促进受损神经元修复和神经干细胞再生，并探讨EphrinB/ephB在神经功能修复中的作用。深入研究电针促进ENS修复的机制，为电针刺激治疗胃肠动力障碍性疾病提供新的理论依据。

目的：结肠动力紊乱在糖尿病患者中很常见，目前电针刺激（EA）已成为治疗结肠动力障碍性疾病的一种有效方法，但其机制尚不明确。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）主要由肠胶质细胞（EGCs）分泌，对肠神经元的存活至关重要。本研究目的是以糖尿病小鼠为模型，研究肠神经系统（ENS）的变化以及EA是否通过GDNF / GFRα1 / Ret，PTEN / PI3K / Akt信号通路保护肠神经元，从而改善结肠传输。.方法:（1）野生型C57BL/6雄性小鼠随机分为两组:正常对照组(N组)、糖尿病组(DM组)。STZ注射诱导1型糖尿病。分别于造模后4、6、8和12周时，通过Western blot和Real-time PCR检测结肠组织中肠神经元PGP9.5、肠胶质细胞GFAP和GDNF的表达。（2）选择8周的DM和EA周期进行研究。小鼠随机分为5组:N组、DM组、DM+假性EA组(DM+SEA组)、DM+低频EA组(DM+LEA组)、DM+高频EA组(DM+HEA组)。成功建立1型DM模型后，开始进行8周EA。EA结束后，检测各组小鼠排便频率和粪便含水量来评估结肠传输。分别使用 Western Blot、Real-time PCR 及免疫荧光双染技术检查结肠组织中PGP9.5、nNOS、GFAP和GDNF的表达，检测GDNF / GFRα1 / Ret，PTEN/PI3K / Akt通路各分子在各组小鼠结肠中的表达差异。.结果:（1）DM 8周后PGP9.5、GFAP、GDNF均出现一定程度的下降；（2）EA促进DM小鼠结肠转运；改善结肠神经元受损，高频EA作用更显著；增加肠神经胶质细胞的数量表达及功能恢复；（3）相比于N组，DM组中GDNF、GFRα1的表达含量降低，EA后出现一定程度恢复，EA作用更显著；各组Ret、PTEN、Akt总蛋白表达含量无明显差异；DM组中p-Akt蛋白表达量降低，EA后升高，高频EA作用显著；p-PTEN蛋白表达量在DM组和N组无明显差异，EA后升高，高频、低频EA无明显差异。.结论: DM小鼠存在结肠神经元、肠胶质细胞损伤和结肠传输减慢；EA可增加DM小鼠结肠组织中EGCs的表达并通过GDNF / GFRα1/ Ret和PTEN/PI3K/ Akt信号通路保护肠神经元，从而改善结肠动力。