缺氧条件下mtDNA3010G基因型个体易感高原肺水肿的分子机制研究

High altitude pulmonary edema (HAPE) is an idiopathic pulmonary edema at high altitude hypoxia environment. The mitochondria are cell's " energy factory", and initial experiments have shown that mt3010A (halpogroup D tagSNP) genotype was a protective factor of HAPE. Besides wild type mt3010G gene exists in the crowd, and the mtDNA copy number varation is the risk factor of HAPE.On the basis of previous studies, we use the fusion technology of ρ0 cells to styudy whether hypoxia would induce the expression changes of some specific microRNA,promoting the geneaation of ROS, affecting the relative molecular in the signal pathway of MARK,inhibiting expression of mtTFA, reduce the effect of mtDNA copy number, eventually leading to the occurrence of HAPE.This research would further reveal the heredititary susceptibilty of mtDNA in HAPE, which lay a solid foundation for finding novel drug target and new waring insexes for HAPE. At the same time, mt3010G genotype is the risk factors of AMS and COPD, this research is also a solid foundation for the genetic mechanism of mitochondrial diseases for them.

高原肺水肿(HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿，有明显遗传易感性。线粒体是细胞的"能量工厂"，其功能与mtDNA多态性(单倍群、单倍型、拷贝数)密切相关。本室前期研究发现mt3010G基因型、mtDNA的拷贝数降低均是HAPE的危险因素，但是mt3010G基因型与mtDNA的拷贝数变化之间的关系尚不清楚。本研究拟通过ρ0细胞的融合技术，深入研究缺氧是否引起mt3010G基因型细胞的特定microRNA表达变化，促进了ROS生成，影响MAPK信号通路相关分子，抑制mtTFA的表达，减少mtDNA拷贝数，最后导致HAPE的发生。进一步揭示HAPE的mtDNA遗传易感机制，为寻找到HAPE的药物防治新靶点、预警新指标打下坚实的基础。同时，mt3010G基因型也是AMS和COPD的危险因素，本研究也为探讨相关疾病的线粒体遗传机制打下坚实基础。

mtDNA 3010多态性参与了中国汉族人群HAPE的发生，本课题通过构建融合细胞模型，综合运用基因测序、细胞生物学、蛋白质生物化学、基因芯片、生物信息学等方法和技术，对mt3010G参与中国汉族HAPE的分子机制进行了初步研究。首先通过基因测序技术，获取mt3010A (3010A，5178G，10400G)和mt3010G(3010G，5178G，10400G)的血小板，再通过细胞融合技术成功获取mt3010A和mt3010G融合细胞。对融合细胞进行1%O2缺氧处理24h后，分别测定其ROS，MMP和ATP的含量变化，电压依赖离子通道蛋白VDAC1和前凋亡蛋白Bax的表达变化，线粒体拷贝数变化。采用RT-PCR的方法，检测ATP合成酶相关基因ATP5I和ATP5A1，MAPK信号通路ERK（MAPK1）、JNK（MAPK8）和mtTFA的表达变化。采用基因芯片的方法，检测1%O2处理24h后的lncRNA和mRNA表达变化，运用生物信息学方法分析差异表达的lncRNA和mRNA。结果表明，在1%O2处理24h后，融合细胞mt3010A和mt3010G的ROS，MMP，ATP，VDAC1蛋白和Bax蛋白以及拷贝数变化无显著差异。与mt3010A融合细胞相比，mt3010G融合细胞的ATP5I，ATP5A1，ERK，JNK和mtTFA表达显著下调。基因芯片结果经生物信息学分析后，提示mt3010A和mt3010G的变异，在缺氧状态下可能涉及多个生物学代谢过程、细胞组份和分子功能的变化，以及多个信号通路的激活。经lncRNA和mRNA联合预测提示基因YES1，YIPF4，THEM4，PLCXD1以及C11orf1等可能是差异表达lncRNA的调控基因，有可能参与了mt3010G致HAPE的发生。在生物信息学分析结果的基础上，挑选出感兴趣的9个基因进行RT-PCR验证，结果显示mt3010A融合细胞的ABCC6，COX1和CYP1B1表达水平明显升高，LOXHD1表达水平显著下降。结合ATP合成酶以及MAPK信号通路分子的表达变化，我们推测mt3010A/G变异所致的线粒体能量代谢变化可能参与了中国汉族人群HAPE的发生。