组蛋白去乙酰化修饰机制在地黄连作障碍形成中的作用

Histone modification is one of the important mechanisms in response to stresses in plants. Our preliminary study found that histone deacetylase targeted to a serious of genes that play a critical roles in consecutive cropping Rehmannia glutinosa L. To confirm roles of histone deacetylation, the following four studies will be conducted on first cropping and consecutive cropping R.glutinosa in this project on bases of the field and simulation experiments (1) Spatial and temporal changes of histone deacetylase and histone modification status in the root cells will be determined by Western Blot and Immunostaining, respectively. (2) Those genes that were closed in consecutive cropping R. glutinosa were captured through using ChIP-seq methods. (3) The difference expression of the key genes from third steps will be analyzed carefully in the roots of control and treatment by qRT-PCR and Northern Blot. (4) Histone deacetylase inhibitor (Trichostatin A) will be applied to treat consecutive cropping R. glutinosa. Simultaneously, the activity of histone deacetylase, expression for genes that closed in consecutive cropping R. glutinosa was further observed by qRT-PCR and Northern Blot. The study will provide important theoretical references and technical information for resolving the problem of consecutive cropping problems.

组蛋白乙酰化修饰是植物响应胁迫的重要机制之一。申请者前期研究发现组蛋白去乙酰化作用关闭了连作地黄生命活动中的一系列核心基因而引发了连作毒害。为了确证组蛋白去乙酰化修饰机制在连作障碍中的作用，本项目拟在大田和模拟条件下对头茬和连作地黄开展以下研究：①采用Western Blot和染色质免疫染色等方法测定头茬和连作地黄根部组蛋白去乙酰化酶的活性及组蛋白修饰位点的时空变化；②运用组蛋白免疫沉淀技术结合高通测序（ChIP-seq）等方法，获取连作地黄中被关闭的与生命活动密切相关的候选基因。③用qRT-PCR技术结合Northern Blot方法，研究连作地黄中被关闭基因在头茬和连作地黄中的时空表达差异；④用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A处理连作地黄根部，观察细胞组蛋白去乙酰化酶活性及植株形态生理指标变化，并分析连作被关闭基因的开启状况。本项目为突破地黄连作障碍难题，提供重要的理论依据和技术支撑。

前期研究发现组蛋白去乙酰化作用在地黄连作障碍形成中扮演着重要角色。为深入揭示组蛋白乙酰化修饰在地黄连作形成中作用，本项目精细分析了地黄组蛋白去乙酰化酶及位点在连作和模拟连作下的表达特征，解析了连作胁迫所开启和关闭细胞进程。主要研究结果如下：. （1）搭建了组培和悬浮细胞模拟连作实验平台。在地黄组培和悬浮细胞体系基础上，利用混合酚酸进行梯度胁迫，结合组培苗和悬浮细胞生理生化伤害指标，阐明了化感物质在组织和细胞水平上的伤害效应，并以此为基础构建了地黄组织和细胞水平上模拟连作体系。. （2）确认了组蛋白乙酰化修饰机制在连作形成中功能模式。利用Sanger测序筛选、确证了地黄组蛋白去乙酰化酶基因信息，并利用qPCR技术分析了其在田间和模拟条件下的转录特征，从中遴选出了与连作障碍密切相关基因，并通过Western blot技术验证了其功能的真实性。同时，利用Western blot 和免疫染色技术对组蛋白乙酰化位点在连作和模拟连作胁迫下蛋白含量变化进行了定量和定性分析，筛选了连作形成密切相关位点。结果在地黄中共鉴定到12个组蛋白去乙酰化酶，其中，5个与连作形成密切相关；4个组蛋白乙酰化位点中的3个在化感胁迫下显著富集，表明在连作障碍形成中组蛋白乙酰化修饰深度介入了连作植株转录调控。. （3）揭示了连作地黄体内关键组蛋白乙酰化位点所参与的细胞进程。利用Chip-Seqs技术鉴定了连作和模拟连作体系中不同样品关键组蛋白乙酰化位点所关联DNA片段信息，并结合转录组和转录保守元件对连作特异富集片段进行了功能确认。发现连作地黄组蛋白乙酰化位点富集的片段信息主要涉及钙信号、激素信号、胁迫响应等关键细胞进程，并且其中包含了Myb、AP2、GATA等转录因子的核心结合位点，表明连作组蛋白乙酰化位点与其体内伤害胁迫进程的启动密切相关。. 本项目通过连作胁迫下组蛋白去乙酰化修饰响应模式解读以及关联位点调控信息解析，填补了连作形成过程中转录层级上调控机制研究空白，为进一步解读地黄连作障碍形成机制提供了重要的基础信息。